霉菌計數如何保證結果準確？

  霉菌計數的準確性直接影響實(shí)驗結果的可信度，尤其在食品、藥品、環(huán)境監測等領(lǐng)域至關(guān)重要。以下從樣品處理、操作規范、培養條件到數據分析等方面總結關(guān)鍵注意事項，幫助提高霉菌計數的準確性：

一、樣品采集與處理

  1.代表性取樣：

  （1）液體樣品（如果汁、牛奶）需充分搖勻后取樣。

  （2）固體樣品（如谷物、土壤）需粉碎后混合均勻，按標準方法（如ISO 21527）進(jìn)行稀釋。

  （3）環(huán)境樣本（如空氣）需使用撞擊式采樣器或沉降法，記錄采樣時(shí)間和流量。

  2.避免交叉污染：

  （1）使用無(wú)菌工具（如滅菌勺、鑷子）操作。

  （2）不同樣品間需更換手套或工具，防止霉菌孢子污染。

二、稀釋與接種規范

  1.梯度稀釋?zhuān)?/span>

  （1）按10倍梯度稀釋?zhuān)ㄈ?0⁻¹到10⁻⁶），每稀釋一步更換吸管或槍頭。

  （2）稀釋液選擇：常用0.1%蛋白胨水或磷酸鹽緩沖液（PBS），避免抑制霉菌生長(cháng)。

  2.接種方法：

  （1）傾注法：取1mL稀釋液注入無(wú)菌平皿，倒入45-50℃的培養基（如孟加拉紅培養基、PDA），混勻凝固。

  （2）涂布法：取0.1-0.2mL稀釋液涂布于預固化的培養基表面，避免劃破瓊脂。

  （3）濾膜法：適用于低污染樣品（如純凈水），過(guò)濾后貼膜于培養基表面。

三、培養基與培養條件

  1.選擇性培養基：

  （1）抑制細菌：添加氯霉素（50-100 mg/L）或慶大霉素（20 mg/L）。

  （2）抑制酵母：添加放線(xiàn)菌酮（0.1-0.5 g/L）。

  （3）常用培養基：孟加拉紅瓊脂（抑制細菌+區分霉菌）、PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂）、DG18（高滲透壓培養基，用于耐干燥霉菌）。

  2.培養條件：

  （1）溫度：25-28℃（多數霉菌），嗜冷菌需低溫培養（如10-15℃）。

  （2）時(shí)間：5-7天（部分慢生菌需延長(cháng)至14天）。

  （3）濕度：保持培養箱濕度＞70%，防止培養基干裂。

四、菌落計數與鑒別

  1.計數規則：

  （1）選擇菌落數30-300 CFU的平板（霉菌菌落較大，可放寬至10-150 CFU）。

  （2）忽略蔓延生長(cháng)的菌落（如毛霉、根霉）或標記為“蔓延菌”。

  （3）重疊菌落處理：若＜1/2面積重疊按1個(gè)計，大面積覆蓋需估算或標記為“TNTC”（Too Numerous To Count）。

  2.霉菌鑒別：

  （1）形態(tài)觀(guān)察：菌落顏色（如青霉青綠色、曲霉黑色）、邊緣特征、背面色素。

  （2）顯微鏡檢查：乳酸酚棉藍染色觀(guān)察孢子結構（分生孢子頭、菌絲隔膜等）。

  （3）必要時(shí)進(jìn)行分子鑒定（如ITS區測序）。

五、誤差控制與質(zhì)控措施

  1.避免主觀(guān)誤差：

  （1）多人獨立計數取平均值。

  （2）使用菌落計數器輔助（避免視覺(jué)疲勞）。

  2.陰性/陽(yáng)性對照：

  （1）陰性對照：空白培養基培養，確認無(wú)菌污染。

  （2）陽(yáng)性對照：接種已知霉菌（如黑曲霉ATCC 16404），驗證培養基有效性。

  3.數據記錄與計算：

  （1）記錄稀釋倍數、菌落數、異�，F象（如蔓延菌、細菌污染）。

  （2）計算方式：CFU/g（或CFU/mL）=平均菌落數 × 稀釋倍數 × 接種量倒數（如接種0.1mL需×10）。

六、常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案

七、標準化與人員培訓

  1.遵循國際/國家標準（如ISO 21527、GB 4789.15-2016）。

  2.定期校準設備（培養箱溫度、移液器精度）。

  3.操作人員需培訓：熟悉霉菌形態(tài)、無(wú)菌操作、數據記錄規范。

  通過(guò)以上步驟的系統控制，可顯著(zhù)減少霉菌計數的誤差，確保實(shí)驗結果的準確性和重復性。對于爭議性結果（如邊緣菌落），建議重復實(shí)驗或采用多種方法交叉驗證。

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