飲用天然礦泉水中糞鏈球菌的檢驗

一、簡(jiǎn)介

  糞鏈球菌又叫糞腸球菌，是一種革蘭染色陽(yáng)性球菌。糞腸球菌是人體腸道內的正常菌群，人的大便中含有大量的糞腸球菌，每克糞便中大約有107個(gè)糞腸球菌。糞腸球菌通常不感染人，但在人應用抑制免疫力藥物導致人體免疫力下降等情況下，會(huì )導致糞腸球菌感染。糞鏈球菌檢驗是飲用天然礦泉水檢驗標準的必檢項目。參考標準為《GB 8538-2022  食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》。糞鏈球菌的檢驗程序如下（圖1）：

圖1 糞鏈球菌的檢驗程序

二、試驗操作

   1、水樣過(guò)濾

   用無(wú)菌鑷子夾取無(wú)菌濾膜邊緣部分，貼放在已滅菌的濾頭上，固定好濾器，將250mL水樣或稀釋后的水樣，通過(guò)孔徑0.45μm的濾膜過(guò)濾（如圖2）。

圖2 水樣過(guò)濾操作步驟

  2、培養

  將過(guò)濾后的濾膜貼在KF鏈球菌瓊脂培養基平板上，濾膜截留細菌面向上，平鋪并避免在濾膜和培養基之間夾留著(zhù)氣泡（如圖3）。將平板倒置，36℃±1℃培養48h±2h。

圖3 濾膜貼到培養基上培養前的狀態(tài)

  3、結果觀(guān)察與計數

  糞鏈球菌典型菌落在濾膜上呈現大小不等的紅色或粉紅色（如圖4），計數可疑菌落。

圖4 濾膜上的菌體培養后的狀態(tài)

  4、確證試驗

  a、從濾膜上按比例挑取10個(gè)不同形態(tài)的可疑菌落（不足10個(gè)則全挑），接種到腦心浸液瓊脂培養基平板上，36℃±1℃培養24h～48h（如圖5）。

圖5 可疑菌株純化后的狀態(tài)

  b、用接種環(huán)從腦心浸液瓊脂培養基平板上挑取培養物進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀(guān)察，可疑菌應為革蘭氏陽(yáng)性球菌（如圖6）。

圖6 革蘭氏陽(yáng)性球菌顯微照片

  c、用接種環(huán)從腦心浸液瓊脂培養基平板上挑取培養物到一片清潔的載玻片上，滴加2滴～3滴新鮮配制的3％過(guò)氧化氫到載玻片的涂抹菌處。

  如果30s內有氣泡發(fā)生，則過(guò)氧化氫酶反應為陽(yáng)性(如圖7左)，則該菌不屬于糞鏈球菌，確證試驗到此即可停止；如果30s內沒(méi)有氣泡發(fā)生（如圖7右），則顯示過(guò)氧化氫酶反應為陰性，則該菌可視為糞鏈球菌可疑菌，需繼續后面的確證過(guò)程。

圖7 過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性和陰性結果

  d、用接種環(huán)從腦心浸液瓊脂培養基平板上挑取單菌落到腦心浸液液態(tài)培養基內，45℃±1℃ 培養48h±2h（如圖8）。

圖8 腦心浸液肉湯中質(zhì)控菌和可疑菌的生長(cháng)情況

（從左到右：糞腸球菌，陽(yáng)性菌，陰性菌，無(wú)菌對照）

  同時(shí)挑取單菌落到膽汁液態(tài)培養基中，36℃±1℃ 培養3d（如圖9）。

  e、若可疑菌落為革蘭氏陽(yáng)性球菌，過(guò)氧化氫酶反應陰性，且分別接種至兩種培養基中，培養后使兩種培養基均變渾濁，則確證為糞鏈球菌（圖10）。

圖10 確證為糞鏈球菌的試驗結果

三、結果與報告

  糞鏈球菌菌落數按下面的公式計算:

  式中：T———每250 mL水中糞鏈球菌的菌落數；

  A———某一稀釋度可疑菌落的總數；

  B———某一稀釋度確證為陽(yáng)性的菌落數；

  C———某一稀釋度用于確證性試驗的菌落數；

  d———稀釋因子。

四、質(zhì)量控制

  實(shí)驗室應根據需要設置陽(yáng)性對照、陰性對照和空白對照，定期對檢驗過(guò)程進(jìn)行質(zhì)量控制。宜選用糞腸球菌標準菌株[CMCC(B) 32482或等效標準菌株］作為陽(yáng)性對照菌株，以大腸埃希氏菌標準菌株[CMCC(B) 43201或等效標準菌株］作為陰性對照菌株。

五、產(chǎn)品展示

  本檢驗過(guò)程中用到的培養基產(chǎn)品信息列舉如下，以期能給廣大檢驗人員提供幫助。

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