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一、簡(jiǎn)要說(shuō)明
GB 4789.40—2024于2024.2.8發(fā)布，于2024年8月8日實(shí)施。新標準與GB 4789.40—2016相比，主要變化如下：
修改了標準名稱(chēng)；
標準適用范圍增加了嬰幼兒輔助食品；
增加了PCR鑒定方法作為選做內容；
刪除了挑取黃色菌落和生化鑒定中產(chǎn)黃色素和苦杏仁苷的項目；
修改了培養基和試劑pH調節方法；
修改預熱、選擇性增菌溫度以及TSA平板的培養溫度和時(shí)間；
修改了生化反應的培養溫度及氨基酸培養基的制備。
二、對比詳情
新舊版標準變更的內容詳細列舉如表1。
表1 新舊標準變更內容詳細對比表格
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變更條目 |
變更內容 |
詳情解釋 |
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標題 |
食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗克羅諾桿菌檢驗 |
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1 范圍 |
本標準適用于嬰幼兒配方食品、嬰幼兒輔助食品、乳及乳制品及其原料中克羅諾桿菌的檢驗。 |
針對使用范圍進(jìn)行了變更，增加了嬰幼兒輔助食品。 |
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第一法克羅諾桿菌定性檢驗 |
克羅諾桿菌定性檢驗 |
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2 設備和材料 |
除微生物實(shí)驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：
2.1 恒溫培養箱： 2.2 冰箱：2℃~5℃，-20℃。 2.3 恒溫水浴箱：41.5℃±1℃。 2.4 天平：感量0.1g、0.01g。
2.5 2.6 無(wú)菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭。 2.7 無(wú)菌容器：容量100mL、200mL、2000mL。 2.8 無(wú)菌培養皿：直徑90mm。 2.9 pH計或pH比色管或精密pH試紙。 2.10 微生物生化鑒定系統。 |
更改了部分儀器設備的參數要求。 |
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2 設備和材料 |
2.11 PCR儀。 2.12 離心機：轉速≥12000r/min。 2.13 凝膠成像系統或紫外檢測儀。 2.14 瓊脂糖水平電泳儀或毛細管電泳儀。 2.15 PCR反應管。 2.16 1.5mL離心管。 2.17 10μL接種環(huán)。 |
新增PCR相關(guān)設備和材料 |
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3 培養基和試劑 |
3.3 克羅諾桿菌顯色培養基。 3.12 內轉錄間隔區（its）PCR引物見(jiàn)表1，基因擴增靶標參考序列見(jiàn)附錄B。 3.13 5U/μL耐熱DNA聚合酶。 3.14 2.5mmol/dNTPs：dATP、dTTP、dCTP、dGTP。 3.15 25mmol/L MgCl2。 3.16 10×PCR緩沖液：見(jiàn)A.10。 3.17 克羅諾桿菌質(zhì)控菌株：具有菌種保藏資質(zhì)單位提供的ATCC 29544或等效菌株。 3.18 大腸埃希氏菌質(zhì)控菌株：具有菌種保藏資質(zhì)單位提供的ATCC 25922或等效菌株。 3.19 DNA提取試劑：細菌基因組DNA提取試劑盒。 3.20商品化PCR反應預混液。 3.21標準（高熔點(diǎn)）瓊脂糖：分析純。 3.22核酸染色劑。 3.23分子質(zhì)量標準：100 bp DNAladder。 3.24 50×TAE電泳緩沖液：見(jiàn)A.11。 3.25 6×DNA加樣緩沖液：見(jiàn)A.12 |
顯色培養基名稱(chēng)更改，新增PCR相關(guān)試劑，新增對質(zhì)控菌株相關(guān)要求。 |
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4 檢驗程序 |
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PCR流程中如果全部陰性可以直接輸出結果為檢測結果陰性，如果陽(yáng)性將進(jìn)行生化鑒定步驟，經(jīng)過(guò)PCR鑒定可以直接在陽(yáng)性純化的TSA平皿上選取菌落進(jìn)行鑒定，未經(jīng)過(guò)PCR步驟需要將可疑菌落依次進(jìn)行生化鑒定直到出現陽(yáng)性或全部為陰性。 |
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5 操作步驟5.1-5.2 |
5.1 前增菌和選擇性增菌
取檢樣100g（mL）置于無(wú)菌容器中，加入900mL已預熱至 5.2 分離
5.2.1 輕輕混勻mLST-Vm肉湯培養物，
5.2.2 可疑菌落按顯色培養基要求進(jìn)行判定，每個(gè)平板挑取至少5個(gè)可疑菌落（不足5個(gè)時(shí)挑取全部可疑菌落），分別劃線(xiàn)接種于TSA平板， |
預熱、選擇性增菌的溫度由44℃和25℃更改為41℃、41.5℃和36℃。 |
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5.3 PCR鑒定（選做） |
PCR試驗環(huán)境條件和過(guò)程控制參照GB/T27403規定執行。 5.3.1 DNA模板制備 可采用熱裂解法制備模板，從每個(gè)TSA平板上挑取2個(gè)~3個(gè)克羅諾桿菌可疑菌落至500μL滅菌去離子水中，充分混勻后100℃加熱10min，冰浴冷卻至室溫，12000r/min離心10min，取上清液作為DNA模板用于PCR鑒定。若上清液不能及時(shí)分析則于-20℃保存備用(1周以?xún)?。 注：也可用等效商品化的細菌基因組DNA提取試劑盒或全自動(dòng)核酸提取儀按操作要求提取DNA模板。 5.3.2 PCR擴增 5.3.2.1 引物 PCR鑒定用引物信息見(jiàn)表1。
5.3.2 PCR擴增 5.3.2.2 PCR反應體系 PCR反應體系組成見(jiàn)表2。
注：也可用商品化PCR反應預混液按要求制備反應體系。 5.3.2 PCR擴增 5.3.2.3 反應條件：94℃預變性5min；94℃變性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，4℃下保存。 5.3.3 對照設置 每次PCR鑒定時(shí)使用克羅諾桿菌標準菌株DNA模板作為陽(yáng)性對照，大腸埃希氏菌標準菌株DNA模板作為陰性對照，提取過(guò)程設置滅菌去離子水作為DNA提取空白對照，PCR反應需另設滅菌去離子水作為PCR反應體系空白對照。 |
新增選做內容PCR鑒定方法 |
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5.3 PCR鑒定（選做） |
5.3.4 電泳 用1×TAE電泳緩沖液制備含核酸染色劑的1.5%瓊脂糖電泳凝膠(核酸染色劑按照說(shuō)明書(shū)要求使用)。在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面沒(méi)過(guò)膠面。將適量PCR擴增產(chǎn)物與6×加樣緩沖液混合后點(diǎn)樣，其中第1孔加入100bp DNAladder。電壓的設置根據公式———電泳槽正負極的距離（cm）×5V/cm計算并設置，電泳時(shí)間為20min~30min。使用凝膠成像系統或紫外檢測儀觀(guān)察和記錄結果。也可采用毛細管電泳儀等設備進(jìn)行電泳。 5.3.5 PCR鑒定結果判定 質(zhì)控系統：陰性對照和空白對照均未出現擴增條帶，陽(yáng)性對照出現預期大�。�282bp，序列信息見(jiàn)附錄B）的擴增條帶，則檢測系統正常。任一種對照出現非上述正常結果，應重做試驗，同時(shí)排除干擾因素。 陽(yáng)性結果：在質(zhì)控系統正常的情況下，待測樣品出現預期大�。�282bp）的擴增條帶，判定PCR結果為陽(yáng)性。 陰性結果：在質(zhì)控系統正常的情況下，待測樣品未出現預期大�。�282bp）的擴增條帶，判定PCR結果為陰性。 |
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5.4確證試驗 |
選做5.3時(shí)，自PCR結果陽(yáng)性的TSA平板上挑取菌落進(jìn)行生化鑒定，PCR結果陰性的TSA平板不再進(jìn)行生化鑒定。 未選做5.3時(shí)，直接將5.2.2的可疑菌落接種TSA平板后進(jìn)行生化鑒定。 可以首先鑒定克羅諾桿菌顯色培養基平板上最具特征性的菌落接種的TSA平板上的菌落。 如果是陽(yáng)性，則不需要測試其他TSA平板上的菌落。 如果是陰性，則選取其他TSA平板上的菌落進(jìn)行鑒定，直到全部為陰性或發(fā)現陽(yáng)性菌落為止。 自TSA平板上直接挑取黃色可疑菌落，進(jìn)行生化鑒定。 為確保結果的準確性，對TSA平板上的菌落進(jìn)行鑒定時(shí)，應使用新鮮的傳代菌落。 克羅諾桿菌屬的主要生化特征見(jiàn)表1。 克羅諾桿菌的主要生化特征見(jiàn)表3。
可選擇生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統。 上述鑒定也可選擇商品化生化鑒定試劑盒或微生物生化鑒定系統進(jìn)行。 |
在生化鑒定步驟中刪除挑取黃色菌落的操作，并刪除產(chǎn)黃色素及苦杏仁苷檢測項目 |
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6 結果與報告 |
根據菌落特征、確證試驗（生化鑒定）和/或PCR鑒定結果，報告100 g（mL）樣品中檢出或未檢出克羅諾桿菌。 |
結果與報告部分加了根據PCR的鑒定結果進(jìn)行報告是否檢出克羅諾桿菌 |
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第二法克羅諾桿菌定量檢驗 |
克羅諾桿菌定量檢驗 |
名稱(chēng)更改 |
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7.1 樣品的稀釋 |
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將固體半固體和液體的取樣稀釋步驟合并，并且也更改了預熱溫度和增菌培養溫度 |
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7.2 分離、鑒定 |
同5.2、5.3和5.4。 |
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8 結果與報告 |
綜合菌落特征、確證試驗（生化鑒定）或PCR鑒定結果，根據檢出克羅諾桿菌的陽(yáng)性管數，查MPN檢索表，報告100g（mL）樣品中克羅諾桿菌的MPN值（見(jiàn)附錄C中表C.1）。 |
報告的要求增加了PCR的鑒定結果 |
新舊版標準培養基變更的內容詳細列舉見(jiàn)表2和表3。
表2 新舊版標準培養基變更內容詳細對比表格（試驗操作方法變更）
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培養基及貨號 |
版本 |
成分 |
配制方法變更 |
試驗操作方法變更 |
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L-賴(lài)氨酸脫羧酶培養基 |
新版 |
L-賴(lài)氨酸鹽酸鹽(L-lysine monohydrochloride) 5.0g 酵母浸膏3.0g 葡萄糖1.0g 溴甲酚紫0.015g 蒸餾水1000mL |
將各成分加熱溶解，必要時(shí)調節pH。每管分裝5mL，上面滴加一層液體石蠟，121℃高壓15min。滅菌后的培養基25℃時(shí)的pH應為6.8±0.2。 |
挑取培養物接種于L-賴(lài)氨酸脫羧酶培養基液面下。36℃±1℃培養24h±2h，觀(guān)察結果。L-賴(lài)氨酸脫羧酶試驗陽(yáng)性者，培養基呈紫色，陰性者為黃色，空白對照管為紫色。 |
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舊版 |
將各成分加熱溶解，必要時(shí)調節pH至6.8±0.2。每管分裝5mL，121℃高壓15min。 |
挑取培養物接種于L-賴(lài)氨酸脫羧酶培養基，剛好在液體培養基的液面下。30℃±1℃培養24h±2h，觀(guān)察結果。L-賴(lài)氨酸脫羧酶試驗陽(yáng)性者，培養基呈紫色，陰性者為黃色，空白對照管為紫色。 |
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L-鳥(niǎo)氨酸脫羧酶培養基 |
新版 |
L-鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽(L-ornithine monohydrochloride) 5.0g 酵母浸膏3.0g 葡萄糖1.0g 溴甲酚紫0.015g 蒸餾水1000mL |
將各成分加熱溶解，必要時(shí)調節pH。每管分裝5mL，上面滴加一層液體石蠟，121℃高壓15min。滅菌后的培養基25℃時(shí)的pH應為6.8±0.2。 |
挑取培養物接種于L-鳥(niǎo)氨酸脫羧酶培養基液面下。36℃±1℃培養24h±2h，觀(guān)察結果。L-鳥(niǎo)氨酸脫羧酶試驗陽(yáng)性者，培養基呈紫色，陰性者為黃色，空白對照管為紫色。 |
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舊版 |
將各成分加熱溶解，必要時(shí)調節pH至6.8±0.2。每管分裝5mL。121℃高壓15min。 |
挑取培養物接種于L-鳥(niǎo)氨酸脫羧酶培養基，剛好在液體培養基的液面下。30℃±1℃培養24h±2h，觀(guān)察結果。L-鳥(niǎo)氨酸脫羧酶試驗陽(yáng)性者，培養基呈紫色，陰性者為黃色。 |
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L-精氨酸雙水解酶培養基 |
新版 |
L-精氨酸鹽酸鹽(L-arginine monohydrochloride) 5.0g 酵母浸膏3.0g 葡萄糖1.0g 溴甲酚紫0.015g 蒸餾水1000mL |
將各成分加熱溶解，必要時(shí)調節pH。每管分裝5mL，上面滴加一層液體石蠟，121℃高壓15min。滅菌后的培養基25℃時(shí)的pH應為6.8±0.2。 |
挑取培養物接種于L-精氨酸脫羧酶培養基液面下。36℃±1℃培養24h±2h，觀(guān)察結果。L-精氨酸脫羧酶試驗陽(yáng)性者，培養基呈紫色，陰性者為黃色，空白對照管為紫色。 |
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舊版 |
將各成分加熱溶解，必要時(shí)調節pH至6.8±0.2。每管分裝5mL。121℃高壓15min。 |
挑取培養物接種于L-精氨酸脫羧酶培養基，剛好在液體培養基的液面下。30℃±1℃培養24h±2h，觀(guān)察結果。L-精氨酸脫羧酶試驗陽(yáng)性者，培養基呈紫色，陰性者為黃色。 |
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新版 |
檸檬酸鈉2.0g 氯化鈉5.0g 磷酸氫二鉀1.0g 磷酸二氫銨1.0g 硫酸鎂0.2g 溴麝香草酚藍0.08g 瓊脂8.0g~18.0g 蒸餾水1000mL |
將各成分加熱溶解（必要時(shí)調節pH）后分裝到試管中，每管10mL，121℃高壓15min，冷卻后制成斜面。滅菌后的培養基25℃時(shí)的pH應為6.8±0.2。 |
挑取培養物接種于9.2中制備的培養基整個(gè)斜面，36℃±1℃培養24h±2h，觀(guān)察結果。陽(yáng)性者培養基變?yōu)樗{色，陰性者為綠色，空白對照管為綠色。 |
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舊版 |
將各成分加熱溶解，必要時(shí)調節pH至6.8±0.2。每管分裝10mL，121℃高壓15min，制成斜面。 |
挑取培養物接種于整個(gè)培養基斜面，36℃±1℃培養24h±2h，觀(guān)察結果。陽(yáng)性者培養基變?yōu)樗{色。 |
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微小變化 |
N，N，N'，N'-四甲基對苯二胺鹽酸鹽1.0g 蒸餾水100mL |
少量新鮮配制，于冰箱內避光保存，在7d之內使用。 |
用玻璃棒或一次性接種針挑取單個(gè)特征性菌落，涂布在用氧化酶試劑濕潤的濾紙平板上。如果濾紙在10s中之內未變?yōu)樽霞t色、紫色或深藍色，則為氧化酶試驗陰性，否則即為氧化酶試驗陽(yáng)性。 |
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糖類(lèi)發(fā)酵培養基 基礎培養基 |
新版 |
酪蛋白(酶消化) 10.0g 氯化鈉5.0g 酚紅0.02g 蒸餾水1000mL |
將各成分加熱溶解，必要時(shí)調節pH。每管分裝5mL。121℃高壓15min。滅菌后的培養基25℃時(shí)的pH應為6.8±0.2。 |
見(jiàn)完全培養基變更 |
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舊版 |
將各成分加熱溶解，必要時(shí)調節pH至6.8±0.2。每管分裝5mL。121℃高壓15min。 |
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糖類(lèi)溶液（D-山梨醇GB108、L-鼠李糖GB112、D-蔗糖GB109、D-蜜二糖GB110） |
新版 |
糖8.0g 蒸餾水100mL |
分別稱(chēng)取D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖等各8.0g，分別溶于100mL蒸餾水中，過(guò)濾除菌后，各制成80mg/mL的糖類(lèi)溶液。 |
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糖類(lèi)溶液（D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、 |
舊版 |
分別稱(chēng)取D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、苦杏仁甙等糖類(lèi)成分各8 g，溶于100mL蒸餾水中，過(guò)濾除菌，制成80mg/mL的糖類(lèi)溶液。 |
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完全培養基 |
新版 |
基礎培養基875mL 糖類(lèi)溶液125mL |
無(wú)菌操作，將8.2.2中制備的每種糖類(lèi)溶液各自加到基礎培養基中，混勻后，分別制成每一種糖的完全培養基，再分裝到無(wú)菌試管中，每管10mL。 |
挑取培養物接種于8.3.2中制備的各種糖類(lèi)發(fā)酵培養基的液面下。36℃±1℃培養24h±2h，觀(guān)察結果。糖類(lèi)發(fā)酵試驗陽(yáng)性者，培養基呈黃色，陰性者為紅色，空白對照管為紅色。 |
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舊版 |
無(wú)菌操作，將每種糖類(lèi)溶液加入基礎培養基，混勻；分裝到無(wú)菌試管中，每管10mL。 |
挑取培養物接種于各種糖類(lèi)發(fā)酵培養基，剛好在液體培養基的液面下。30℃±1℃培養24h±2h，觀(guān)察結果。糖類(lèi)發(fā)酵試驗陽(yáng)性者，培養基呈黃色，陰性者為紅色。 |
表3 新舊版標準培養基變更內容詳細對比表格（無(wú)試驗操作方法變更）
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培養基 |
版本 |
成分 |
制法 |
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緩沖蛋白胨水（buffered peptone water，BPW） HB4080（9mL HBPT031、含900mL BPW HBJ002-1、90mL BPW HBJ002-3） 緩沖蛋白胨水(BPW) |
新版 |
蛋白胨10.0g 氯化鈉5.0g 磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O) 9.0g 磷酸二氫鉀1.5g 蒸餾水1000mL |
加熱攪拌至溶解，必要時(shí)調節pH，121℃高壓滅菌15min。滅菌后的培養基25℃時(shí)的pH應為7.2±0.2。 |
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舊版 |
加熱攪拌至溶解，調節pH至7.2±0.2，121℃高壓滅菌15min。 |
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改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（mLST）肉湯 |
新版 |
氯化鈉34.0g 胰蛋白胨20.0g 乳糖5.0g 磷酸二氫鉀2.75g 磷酸氫二鉀2.75g 十二烷基硫酸鈉0.1g 蒸餾水1000mL |
加熱攪拌至溶解，必要時(shí)調節pH。分裝至無(wú)菌試管中，每管10mL，121℃高壓滅菌15min。滅菌后培養基25℃時(shí)的pH應為6.8±0.2。 |
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舊版 |
加熱攪拌至溶解，調節pH至6.8±0.2。分裝每管10mL，121℃高壓滅菌15min。 |
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萬(wàn)古霉素溶液 HB0102-2a |
未更改 |
萬(wàn)古霉素10.0mg 蒸餾水10.0mL |
10.0mg萬(wàn)古霉素溶解于10.0mL蒸餾水中，過(guò)濾除菌。萬(wàn)古霉素溶液可以在0℃~5℃保存15d。 |
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改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬(wàn)古霉素（modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycin mediu，mLST-Vm） HB0102-2改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬(wàn)古霉素（mLST-Vm） |
微小更改 |
- |
每10mL mLST加入萬(wàn)古霉素溶液0.1mL，混合液中萬(wàn)古霉素的終濃度為10μg/mL。 注：mLST-Vm需在24h之內使用。 |
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胰蛋白胨大豆瓊脂（trypticase soy agar，TSA） HB0177 |
新版 |
胰蛋白胨15.0g 植物蛋白胨5.0g 氯化鈉5.0g 瓊脂15.0g 蒸餾水1000mL |
加熱攪拌至溶解，必要時(shí)調節pH，121℃高壓15min，滅菌后的培養基25℃時(shí)的pH應為7.3±0.2。 |
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胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA） |
舊版 |
加熱攪拌至溶解，煮沸1min，調節pH7.3±0.2，121℃高壓15min。 |
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10×PCR緩沖液 |
新版 |
1mol/L Tris-HCl（pH8.5）840mL 氯化鉀（KCl）37.25g 滅菌去離子水160mL |
將氯化鉀置于少許1mol/L Tris-HCl（pH8.5）中，充分溶解后用1mol/L Tris-HCl（pH8.5）定容至1000mL，121℃高壓滅菌15min，分裝后-20℃保存。 |
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50×TAE電泳緩沖液 |
新版 |
Tris 242.0g EDTA-2Na(Na2EDTA·2H2O) 37.2g 冰乙酸(CH3COOH) 57.1mL 滅菌去離子水942.9mL |
將Tris和EDTA-2Na同時(shí)溶于800mL滅菌去離子水，充分攪拌均勻；加入冰乙酸，充分溶解后，用1mol/L NaOH調pH至8.3，并用去離子水定容至1000mL后，室溫保存。使用時(shí)用去離子水稀釋50倍即為1×TAE電泳緩沖液。 |
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6×DNA加樣緩沖液 |
新版 |
溴酚0.5g 二甲苯氰FF 0.5g 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 0.06mL 甘油360mL 滅菌去離子水640mL |
0.5mol/L EDTA（pH8.0）溶于500mL滅菌去離子水中，加入溴酚藍和二甲苯氰FF溶解，與甘油混合，并用滅菌去離子水定容至1000mL，分裝后4℃保存。 |
三、對比解讀
（1）標準適用范圍：標準名稱(chēng)更改，適用范圍進(jìn)行更改，增加了嬰幼兒輔助食品。
（2）預熱、選擇性增菌的溫度由44℃和25℃更改為41℃、41.5℃和36℃，顯色培養基的名稱(chēng)更改。
（3）新增選做檢測方法PCR法，并且PCR流程中如果全部陰性可以直接輸出結果為檢測結果陰性，如果為陽(yáng)性將進(jìn)行生化鑒定步驟，經(jīng)過(guò)PCR鑒定可以直接在陽(yáng)性純化的TSA平皿上選取菌落進(jìn)行鑒定，未經(jīng)過(guò)PCR步驟需要將可疑菌落依次進(jìn)行生化鑒定直到出現陽(yáng)性或全部為陰性。
（4）部分儀器設備增加參數要求，新增PCR相關(guān)儀器設備與耗材試劑。
（5）在生化鑒定步驟中刪除挑取黃色菌落的操作，并刪除產(chǎn)黃色素及苦杏仁苷檢測項目。
（6）新版將定量檢驗步驟中，樣品的處理進(jìn)行變更，將固體半固體和液體的取樣稀釋步驟合并，并且也更改了預熱溫度和增菌培養溫度。其他分離鑒定步驟與定性檢驗相同
（7）結果與報告部分增加了根據PCR的鑒定結果進(jìn)行報告是否檢出克羅諾桿菌。
四、涉及產(chǎn)品
新版本中主要對培養基的配制方式和使用試驗操作進(jìn)行變動(dòng)，配制方式中增加了液體石蠟覆蓋和對pH的調節要求，試驗操作中的培養溫度進(jìn)行變更等。詳細信息前文以提及。涉及的培養基產(chǎn)品信息見(jiàn)表4，名稱(chēng)與貨號在新舊標準中一致。
表4 新標準中涉及的培養基及編號
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序號 |
名稱(chēng) |
貨號 |
序號 |
名稱(chēng) |
貨號 |
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1 |
9 |
||||
|
2 |
10 |
||||
|
3 |
11 |
||||
|
4 |
12 |
||||
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5 |
（推薦氧化酶試紙） |
（HB2100） |
13 |
||
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6 |
14 |
||||
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7 |
15 |
||||
|
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