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一、簡(jiǎn)介
在實(shí)驗室檢驗工作中，經(jīng)常會(huì )從樣品中分離出一些細菌，為了對這些細菌進(jìn)一步研究，首先需要明確這些細菌的種屬類(lèi)別。本文主要對未知菌種屬分類(lèi)的確定方法進(jìn)行闡述。
目前基因測序是最直接快速的菌種確定方法。但是實(shí)驗室中，往往還需要采用傳統的鑒定方法進(jìn)行菌種鑒定。傳統鑒定方法操作簡(jiǎn)單，成本低廉，不需要復雜設備，適用于一般實(shí)驗室進(jìn)行菌株鑒定。
二、常見(jiàn)細菌的鑒定方法
菌種鑒定是需要專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行操作的一種實(shí)驗室活動(dòng)，為了達到菌種鑒定的目的，一些常規的試驗操作和鑒定方法是必須具備的基本技能。常見(jiàn)的細菌鑒定方法有三大類(lèi)：形態(tài)特征、培養及生理特性、生化特性測定。
1、形態(tài)特征
（1）革蘭氏染色
（2）鞭毛染色
（3）運動(dòng)性
（4）芽孢染色
（5）抗酸染色
（6）莢膜染色
2、培養及生理特性
（1）菌落形態(tài)：用劃線(xiàn)法將菌種接在平板培養基上，適溫培養1d～2d，出現單菌落開(kāi)始觀(guān)察，包括形狀、大小、邊緣、表面、隆起、透明度、菌落和培養基的顏色等。
（2）生長(cháng)溫度和耐熱性：將菌種轉接到幾支試管中，分別在不同溫度下培養，每個(gè)溫度設2管，目測生長(cháng)情況。
（3）芽孢菌厭氧性測定：將菌種用接種環(huán)穿刺接種在厭氧培養基中，30℃培養，3d和7d分別觀(guān)察，表面生長(cháng)者為好氧菌，如沿穿刺線(xiàn)或下部生長(cháng)者為兼性厭氧菌或厭氧菌。
（4）碳源利用：將菌種接種在各種碳源基礎液體培養基（碳源分別為蔗糖、乳糖、果糖、木糖、半乳糖、甘露醇等，終濃度為0.1%～0.2%）中，適溫培養1d，以菌懸液接種，能生長(cháng)者即培養基變渾濁判為陽(yáng)性，否則為陰性。
（5）氮源利用：將菌種接種在各種氮源基礎液體培養基（氮源分別為氨態(tài)氮如磷酸氫二銨或硝態(tài)氮如硝酸鉀、乳糖、果糖、木糖、半乳糖等，終濃度為0.2%～0.5%）中，適溫培養1d，以菌懸液接種，能生長(cháng)者即培養基變渾濁判為陽(yáng)性，否則為陰性。
（6）檸檬酸鹽利用：將菌種接種在檸檬酸鹽基礎液體培養基總，適溫培養3d～7d，培養基變?yōu)樘壹t色者判為陽(yáng)性，否則為陰性。
（7）耐鹽性和需鹽性：將菌種分別接種在含3%，5%，7%，10%含NaCl的肉汁胨液體培養基中，適溫培養3d、7d，目測生長(cháng)情況。
（8）丙酸鹽利用：將菌種接種在丙酸鹽基礎液體培養基中，適溫培養3d～7d，培養基變?yōu)樘壹t色者判為陽(yáng)性，否則為陰性。
3、生化特性測定
（1）氧化酶：將1%的四甲基對苯二胺水溶液滴于干凈培養皿的濾紙上，濾紙濕潤即可，用塑料接種環(huán)取18h～24h的菌苔涂抹于濕潤濾紙上，在10s內涂抹的菌苔呈藍色為陽(yáng)性，60s以上呈藍色者不計，按陰性處理。
（2）觸酶：將24h培養的斜面菌種，用塑料接種環(huán)取菌苔涂抹于已滴有3%過(guò)氧化氫的玻片上，如有氣泡產(chǎn)生則為陽(yáng)性，無(wú)氣泡產(chǎn)生為陰性。
（3）葡萄糖氧化發(fā)酵：將24h幼齡菌種穿刺接種OF培養基，每株4支，其中2支上面覆蓋石蠟油，適溫培養1d、3d、7d、14d觀(guān)察，只有開(kāi)管變黃者為氧化型，開(kāi)管和閉管均變黃者為發(fā)酵型。
（4）甲基紅（MR）：培養48h的菌種試管培養液中加入一滴甲基紅試劑，紅色為甲基紅陽(yáng)性反應，黃色為陰性反應。
（5）V-P測定：將培養24h的菌種培養液，加入V-P試劑，培養液出現紅色，即為試驗陽(yáng)性反應，有時(shí)需要放置更長(cháng)時(shí)間才能出現紅色。
（6）淀粉水解：將菌種接在淀粉瓊脂培養基（在肉汁胨中加入0.2%的可溶性淀粉）上，培養2d～5d，形成明顯菌落后，將碘液滴在平板上，觀(guān)察菌落周?chē)袩o(wú)透明圈。菌落周?chē)缬胁蛔兩耐该魅�，表示淀粉水解�?yáng)性；仍藍色為陰性。
（7）脲酶：指示劑變紅者為陽(yáng)性，不變?yōu)殛幮浴?/span>
（8）苯丙氨酸脫氨酶：變綠為陽(yáng)性反應，不變?yōu)殛幮苑磻?/span>
（9）明膠液化：將菌株接種在明膠液化培養基中，25℃～28℃培養，于5d、10d、20d、30d觀(guān)察液化程度。
（10）牛奶分解：將新鮮菌種接于石蕊牛奶中，25℃～28℃培養，于3d、5d、10d、20d、30d觀(guān)察，還原-石蕊褪色變白；胨化-牛奶變清；產(chǎn)酸-石蕊變紅；產(chǎn)堿-石蕊變藍；酸凝和酶凝-牛奶結塊、凝固。
（11）硝酸鹽還原：將菌種接種于硝酸鹽液體培養基中，適溫培養1d、3d、5d。用滴加A液及B液溶液變?yōu)榉奂t色、橙色、棕色等為硝酸鹽陽(yáng)性，否則為陰性。
上面列出的只是一些常用的生化反應，能幫助細菌鑒定的生化試驗有四十多種，需要時(shí)可以查閱資料進(jìn)行操作。
三、示例說(shuō)明
下面以伯杰手冊為依托，詳細事例說(shuō)明未知細菌的鑒定程序和方法。
1、十大類(lèi)群的確定
圖1 常見(jiàn)細菌類(lèi)群檢索總圖
參考“常見(jiàn)細菌類(lèi)群檢索總圖”（圖1），首先通過(guò)測定細胞壁是否含肽聚糖、膜脂是否以脂鍵相連，確定待鑒定菌為真細菌還是古細菌。
對于確定是真細菌的菌株，依次通過(guò)對光的需求性、產(chǎn)芽孢情況、革蘭氏染色結果和對氧氣的需求情況，確定出屬于哪個(gè)大類(lèi)群。細菌九大類(lèi)群如下：
（1）光合細菌
（2）產(chǎn)芽孢細菌
（3）好氧或兼性厭氧發(fā)酵型革蘭氏陰性桿菌
（4）好氧或兼性厭氧非發(fā)酵型革蘭氏陰性桿菌
（5）嚴格厭氧的革蘭氏陰性球菌
（6）革蘭氏陰性、厭氧直桿、彎桿和螺桿菌
（7）革蘭氏陽(yáng)性好氧和兼性厭氧球菌
（8）好氧和兼性厭氧的革蘭氏陽(yáng)性桿菌
（9）厭氧的革蘭氏陽(yáng)性桿菌和球菌
2、對于已經(jīng)確定了大類(lèi)群的細菌，再按照所屬大類(lèi)的檢索圖進(jìn)一步確認其所屬的種屬。例如，通過(guò)第一步操作，確定該菌為“好氧或兼性厭氧發(fā)酵型革蘭氏陰性桿菌”，則可以通過(guò)“好氧或堿性厭氧革蘭氏陰性發(fā)酵桿菌檢索圖（圖2）”，進(jìn)行氧化酶試驗、鞭毛運動(dòng)性、是否寄生于脊椎動(dòng)物鳥(niǎo)類(lèi)、最適溫度<30℃、是否需要NaCl、是否積累PHB、是否具有脂酶、能否利用甘露醇等試驗，進(jìn)一步找到其所在的科或屬。
從圖2可以看出，好氧或兼性厭氧發(fā)酵型革蘭氏陰性桿菌類(lèi)群中共包含7大科屬，分別為腸桿菌科、巴斯德氏菌科、水棲菌屬、發(fā)光桿菌屬、弧菌屬、氣單胞菌屬和鄰單胞菌屬。
圖2 好氧或兼性厭氧革蘭氏陰性發(fā)酵桿菌檢索圖
3、對于已經(jīng)確定了科、屬的菌種，再進(jìn)一步通過(guò)相應的檢索表，找到其所在的種屬。例如，待鑒定菌已經(jīng)確定為腸桿菌科菌種，再參考“腸桿菌科屬、種檢索表（圖3）”進(jìn)一步通過(guò)苯丙氨酸脫羧酶試驗、V-P試驗、明膠液化實(shí)驗、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶試驗等系列生化試驗，根據試驗結果，最終確定其種屬。
圖3 腸桿菌科屬、種檢索表（部分展示）
上圖中，可以清晰地確定出奇異變形菌、阪崎腸桿菌、普通變形菌等。
4、也可通過(guò)“腸桿菌科內種間鑒別表”（圖4），設置系列試驗，根據結果判斷待鑒定菌屬于哪個(gè)種。
圖4 腸桿菌科內種間鑒別表（部分展示）
四、簡(jiǎn)便方法
對于常見(jiàn)細菌，也可以先通過(guò)革蘭氏染色，確定其為革蘭氏陰性菌還是革蘭氏陽(yáng)性菌，對于已經(jīng)確定的革蘭氏陰性細菌，可以使用我公司快檢產(chǎn)品——博檢系統，直接確認其所在的種屬。有關(guān)博檢系統詳情和使用方法等可參考：博檢革蘭氏陰性細菌鑒定系統。
五、參考文獻
東秀珠,蔡妙英.《常見(jiàn)細菌系統鑒定手冊》（1999）。
注：本文屬海博生物原創(chuàng )，未經(jīng)允許不得轉載。
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