一、背景介紹

  在中國藥典中，對于藥品中梭菌檢驗的分離培養使用的是哥倫比亞瓊脂，而在進(jìn)行方法驗證時(shí)，則使用質(zhì)控菌株生孢梭菌對培養基的靈敏度進(jìn)行測試。然而，許多人在培養生孢梭菌時(shí)候發(fā)現，用硫乙醇酸鹽流體培養基可以比較容易的成功培養生孢梭菌，但用哥倫比亞瓊脂經(jīng)常培養不成功，也會(huì )遇到有時(shí)候成功有時(shí)候失敗，或者計數少很多，結果不穩定，有時(shí)候懷疑是不是培養基有問(wèn)題，結果買(mǎi)來(lái)中檢院的對照培養基使用也是相同的結果，有時(shí)候做出來(lái)遠不如TSA平板計數多，也懷疑過(guò)厭氧環(huán)境的問(wèn)題，在此，我們對可能出現的原因進(jìn)行了多方面的測試和分析。

二、培養失敗原因及細節操作分析

  1.培養基除氧。

  這個(gè)是我們發(fā)現導致培養失敗的最主要原因。通過(guò)對哥倫比亞瓊脂平板的多次測試，培養不成功的主要原因就是配制好的哥倫比亞瓊脂平板在正常的空氣環(huán)境中存放，氧氣會(huì )逐漸滲入到平板中，在接種生孢梭菌后會(huì )對生孢梭菌產(chǎn)生毒害作用，導致生長(cháng)數量偏少或者不生長(cháng)。且平板在空氣中放置時(shí)間越長(cháng)，效果會(huì )越差，短期存放會(huì )導致計數結果明顯偏少，長(cháng)時(shí)間存放則會(huì )導致生孢梭菌幾乎不生長(cháng)。

  因此，在哥倫比亞平板使用之前，將平板放置于厭氧環(huán)境中靜置24h左右，使平板中的氧氣充分逸出，此時(shí)再使用時(shí)生孢梭菌就可以生長(cháng)的很好了。除氧可以采用厭氧包處理，也可以將平板放在厭氧培養箱、氮氣箱等環(huán)境中均可達到理想效果，以下是我們測試的部分實(shí)驗數據：

  實(shí)驗數據可以看出，長(cháng)時(shí)間放置的哥倫比亞平板如果未除氧，接種＜100CFU的生孢梭菌都不生長(cháng)，除氧使用后的哥倫比亞平板回收率明顯高了許多，甚至超過(guò)了未除氧TSA平板的計數結果（經(jīng)過(guò)多次測試，如果將TSA與哥倫比亞都除氧后再進(jìn)行準確計數對比，生孢梭菌生長(cháng)數量是差不多的，但TSA受氧氣影響較小，制備好的TSA平板即使存放在空氣中很長(cháng)時(shí)間不進(jìn)行除氧操作，接種生孢梭菌依然可以較好的生長(cháng)，TSA除氧后的回收率提升不大，這一點(diǎn)與哥倫比亞平板明顯不同，其他品牌的TSA目前未進(jìn)行測試），因此哥倫比亞瓊脂平板除氧這一步操作對實(shí)驗的成功至關(guān)重要。

  2.操作時(shí)間的影響

  理想狀態(tài)下，對于生孢梭菌這類(lèi)絕對厭氧菌的操作應當完全在厭氧箱內操作是最好的，可以很大程度上避免厭氧菌的死亡。但由于許多實(shí)驗室并不具備厭氧操作的條件，因此只能在正常環(huán)境中操作，而生孢梭菌暴露在空氣中是極容易死亡的（上述驗證試驗為最大程度確保試驗的數據的準確性，菌種稀釋、取出培養基、涂布操作到放入厭氧環(huán)境內培養，整個(gè)流程不超過(guò)10min），所以進(jìn)行操作中必須動(dòng)作要快，盡可能的減少培養基和生孢梭菌在空氣中暴露的時(shí)間，更容易成功。

  3.稀釋液的選擇

  0.1%蛋白胨水、pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液理論上是優(yōu)于生理鹽水的，特別是操作慢的時(shí)候，生孢梭菌在生理鹽水中更容易死亡，但在快速操作的時(shí)候，稀釋液的影響不大。

  4.平皿的透氣性

  由于接種后的平板要置于厭氧環(huán)境培養，平皿的蓋子必須要確保透氣性良好，可以與厭氧環(huán)境中的氣體流動(dòng)交換，嚴禁纏封口膜等會(huì )導致平皿密閉的操作。

  5.平板的水汽

  在使用小型的厭氧罐、厭氧盒或厭氧培養袋等裝置時(shí)，由于環(huán)境密閉，培養過(guò)程中水汽不會(huì )散出去，會(huì )在內部形成水汽，若在平皿蓋子上形成大量水汽，有時(shí)候會(huì )導致蓋子與底皿緊密貼合，平皿內氣體不流通，培養失敗。因此在做試驗前，務(wù)必做好充分準備，可先將哥倫比亞平板預先在超凈工作臺中開(kāi)蓋吹15-30min去除表面水汽進(jìn)行適當的干燥處理，再將平皿除氧24h后直接使用。

  6.厭氧環(huán)境

  厭氧環(huán)境對生孢梭菌的生長(cháng)時(shí)至關(guān)重要的，可以采用厭氧培養箱，或者使用厭氧罐、厭氧盒、厭氧培養袋等裝置，密切監視裝置內的環(huán)境狀況（可使用氧氣指示劑進(jìn)行監測），確保厭氧環(huán)境沒(méi)有問(wèn)題。

相關(guān)產(chǎn)品：

哥倫比亞瓊脂培養基（中國藥典）-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情

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