核酸雜交法篩選

利用堿基配對的原理進(jìn)行分子雜交是核酸分析的重要手段，也是鑒定基因重組體的常用方法。核酸雜交法的關(guān)鍵是獲得有放射性或非放射性但有其他類(lèi)似放射性的探針，探針的 DNA或RNA序列是已知的。根據實(shí)驗設計，先制備含目的DNA片段的探針，隨后采用雜交方法進(jìn)行鑒定。

核酸分子雜交的基本原理是：具有互補的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA分子，當它們混合在一起時(shí)，其特定的同源區將會(huì )退火形成雙鏈結構。利用放射性同位素³²P標記的DNA或RNA作探針進(jìn)行核酸雜交，即可進(jìn)行重組體的篩選與鑒定。

在DNA雜交實(shí)驗中，目的DNA先變性，然后把單鏈的目的DNA在高溫下結合到硝酸纖維素膜或尼龍膜上。單鏈DNA探針用放射性同位素或其他物質(zhì)進(jìn)行標記，與膜一起保溫。如果DNA探針與樣品中的某一核苷酸序列互補的話(huà)，那么通過(guò)堿基配對作用就可形成雜合分子，最后通過(guò)放射自顯影或其他方式檢測出來(lái)。通常，探針的長(cháng)度在100bp至1kb之間，但有時(shí)用小于100bp或大于1kb的探針，也能得到較好的效果。雜交的反應條件非常重要，穩定的結合往往需要在最少50個(gè)堿基的片段中至少80%的堿基完全配對。

DNA探針既可用同位素標記，也可用生物素（biotin）等非同位素標記物連接到其中一種脫氧核糖核苷三磷酸中，然后摻入到新合成的DNA鏈。要檢測這種標記需要一種中間化合物——鏈霉抗生物素蛋白（streptavidin）。該化合物能與生物素結合，同時(shí)細胞自身帶有某種酶，可以催化形成有顏色的化合物，最后結果很容易易分辨出來(lái)。

核酸分子雜交的方法有：原位雜交、Southern 雜交及點(diǎn)雜交等。

將含重組體的菌落或噬菌斑由平板轉移到濾膜上并釋放出DNA，變性并固定在膜上，再同DNA探針雜交的方法稱(chēng)為原位雜交。Southern 雜交是一種典型的異位雜交，1975年由Southern設計創(chuàng )建并以他的名字命名。該方法將重組體 DNA 用限制酶切割，分離出目的 DNA后進(jìn)行電泳分離，再將其原位轉至薄膜上，固定后用探針雜交。

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