示蹤劑技術(shù)

為了確定構成最終產(chǎn)物分子的初級代謝產(chǎn)物“建筑構件”的來(lái)源，一種最有用的技術(shù)是應用放射性同位素標記的示蹤劑。將具有放射性同位素¹⁴C、³H或¹³C標記的抗生素生物合成前體物質(zhì)加人生產(chǎn)該抗生素的微生物培養基中，最佳加人時(shí)間是微生物生長(cháng)階段的末期，當培養結束后，將抗生素分離、提純，然后測定結合到抗生素分子中的同位素，從放射性同位素的計數就可以獲得前體物質(zhì)結合到抗生素分子的程度。在分析數據時(shí)應該注意兩點(diǎn)：一是示蹤物質(zhì)雖然是抗生素合成的前體物質(zhì)，但由于不能通過(guò)微生物的細胞壁吸收而得出不是前體物質(zhì)的錯誤結論，事實(shí)上如果該物質(zhì)能夠進(jìn)人細胞內就可以結合到抗生素分子中；二是在抗生素分子中雖然檢測出了示蹤物質(zhì)，但示蹤物質(zhì)已經(jīng)在細胞中通過(guò)其他代謝途徑降解，真正結合到抗生素分子的是示蹤物的降解產(chǎn)物。為了避免上述誤差，可以采用雙重標記的示蹤物，如前體分子同時(shí)有¹⁴C和³H的標記。

在確定了抗生素分子中結合進(jìn)去了某一前體物后，下一個(gè)任務(wù)是確定該前體在抗生素分子結構中的位置，這樣就要將抗生素分子降解為一定的小片段，然后確定標記物在哪一個(gè)片段中，這是一個(gè)困難而又耗時(shí)的工作。一個(gè)比較有效的替代方法是用¹³C標記的前體物。¹³C在自然界的豐度有11%，表面看來(lái)似乎會(huì )干擾測定結果，但它的優(yōu)點(diǎn)是能夠合成¹³C的含量高達99%的化合物，因此自然豐度的干擾可以忽略不計。將用¹³C合成的前體加入培養基中進(jìn)行抗生素發(fā)酵，得到的產(chǎn)物可以直接用核磁共振（NMR）譜峰的高度增加值判斷抗生素分子的每個(gè)碳原子中¹³C所占的分數。如能采用雙重標記的前體物，則可以根據譜峰多重性的高分辨分析和偶合常數來(lái)判斷兩個(gè)原來(lái)相連的原子在經(jīng)過(guò)復雜的代謝過(guò)程后是否還繼續相連，或連接鍵雖然已經(jīng)斷裂但經(jīng)不同的途徑結合到了抗生素分子中。

如果不能確定合理的前體物，則可以采用放射性標記的更普通的底物分子，如葡萄糖或甘油，同時(shí)結合中間代謝產(chǎn)物的確定，也能對研究抗生素代謝途徑提供有用的信息。此外，用氘標記的前體物產(chǎn)生的抗生素用NMR譜進(jìn)行研究也很有用，氘在質(zhì)子共振譜中不出現譜峰，很容易鑒別。

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