一、簡(jiǎn)介

  革蘭氏染色（Gram Staining）是用來(lái)鑒別細菌的一種方法：這種染色法利用細菌細胞壁上的生物化學(xué)性質(zhì)不同，可將細菌分成兩類(lèi)，即革蘭氏陽(yáng)性（Gram Positive）與革蘭氏陰性（Gram Negative）。

  有關(guān)革蘭氏染色的方法、原理、操作步驟和實(shí)驗現象，本公司網(wǎng)站都有很詳細的介紹，具體請參考：http://10759.cn/microknowsear.asp?keyword=%B8%EF%C0%BC%CA%CF%C8%BE%C9%AB

  但經(jīng)常有試驗人員做出的結果出現各種異常，同種菌體不同的人染出的結果不一樣，同一個(gè)人使用同樣的染色液，每次染出的結果也不完全相同。針對這些問(wèn)題，本文就該實(shí)驗過(guò)程中的注意事項做出較為全面的整理，以期對廣大實(shí)驗人員有所幫助。

二、影響因素

（1）試劑的質(zhì)量 

  首先應該保證我們使用的試劑必須是有效的。實(shí)驗室應當建立有效的試劑管理程序，從試劑的驗收到存放、使用、過(guò)期后的廢棄處理都應有嚴格規定，確保試劑有效。

  A、結晶紫的濃度太高，就會(huì )使染上的顏色不容易被酒精脫色，可能會(huì )使革蘭陰性菌染成革蘭陽(yáng)性菌。

  B、碘液作為媒染劑能增加染料與被染物的親和力。如果碘液放置時(shí)間太長(cháng)，或經(jīng)日光照射失效，失去媒染劑的作用，就可能使結晶紫與細菌結合的不牢固，容易被脫色，使革蘭陽(yáng)性菌染成革蘭陰性菌。

  C、酒精作為脫色劑，革蘭染色的脫色酒精濃度為95%，在此濃度下革蘭陽(yáng)性菌染上的結晶紫不易被脫去，保留紫色，革蘭陰性菌染上的結晶紫容易被脫去，最后呈紅色。但當酒精濃度不同時(shí)，它的脫色能力也可能有所差異。

  為了保證試劑的統一有效性，建議使用商品化的成套試劑。我公司革蘭氏染色成套試劑貨號為：HB8278，其性能及相關(guān)資料可參閱：http://10759.cn/asphtml/product374.htm。

（2）菌株

  A、培養基的成分  有資料顯示革蘭陽(yáng)性菌體內含有特殊的核蛋白質(zhì)鎂鹽與多糖的復合物，它與碘和結晶紫的復合物結合很牢，不易脫色。但是如果培養基中缺乏核蛋白質(zhì)鎂鹽就不能合成菌體成分的核蛋白質(zhì)鎂鹽，細菌與碘和結晶紫的復合物結合就不牢固，容易脫色，可能會(huì )使革蘭陽(yáng)性菌染成革蘭陰性菌。所以盡量選擇在一般營(yíng)養瓊脂上純化培養的菌株進(jìn)行染色。

  B、菌齡  細菌的典型形態(tài)、染色性是在對數生長(cháng)期，取這時(shí)的細菌做革蘭染色可以反應細菌的真實(shí)的染色性。如果細菌培養時(shí)間太長(cháng)，變成了老齡菌，染色性就會(huì )發(fā)生變化，可能會(huì )使革蘭陽(yáng)性菌染成革蘭陰性菌。

  C、涂片  涂片時(shí)，挑取菌體后應該在無(wú)菌水上涂成薄薄的菌膜。若是菌體堆積太厚，往往菌體之間變得毫無(wú)縫隙，而造成脫色效果不佳，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性的結果，極大影響染色結果的準確性。因此在涂片過(guò)程一定要將菌膜涂得少而均勻，這樣才能達到最佳效果。同時(shí)，在初染、媒染及復染的過(guò)程中，應將染液覆蓋整個(gè)菌膜，避免一部分菌染色而另一部分菌沒(méi)有染色。

（3）溫度

  固定不僅能殺死細菌，改變細菌對染料的通透性，還能使細菌吸附在玻片上，保持原有的形態(tài)結構。固定方法是將干燥后的細菌涂片以中等速度通過(guò)火焰三次，以玻片觸及手背皮膚熱而不燙為宜。但在實(shí)際操作中有的人員將玻片在火焰上烤的太久，改變了細菌原有的通透性，會(huì )使細菌的染色性發(fā)生變化，影響了染色的結果。

  另外菌體固定后，如果載玻片的溫度還沒(méi)完全降下來(lái)，就直接用結晶紫初染，也會(huì )造成革蘭氏陰性菌顏色偏深，誤判成假陽(yáng)性（如圖1）。

圖1 載玻片不同溫度時(shí)進(jìn)行結晶紫初染的試驗結果差異

（左：未完全冷卻，藍紫色   右：完全冷卻，紅色）

（4）時(shí)間

  A、染色時(shí)間  結晶紫初染和碘液媒染時(shí)間對革蘭氏陰性菌的染色結果有很大影響。時(shí)間過(guò)長(cháng)，結晶紫在碘液長(cháng)時(shí)間作用下過(guò)分牢固結合在菌體細胞壁上，影響了酒精的脫色效果，從而會(huì )導致假陽(yáng)性的效果。以典型的革蘭氏陰性菌大腸埃希氏菌為例，有人做過(guò)統計，媒染時(shí)間嚴格控制在40 s-60 s之內，染色結果準確率基本可達到100%，而超過(guò)60 s準確率會(huì )有一定的降低，若媒染超過(guò)100 s，準確率甚至可降低接近20%左右。因此在媒染過(guò)程中一定要注意媒染時(shí)間。

  B、脫色時(shí)間  陽(yáng)性菌透性小，不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色；但這是在固定的時(shí)間條件下的結果，如果延長(cháng)脫色時(shí)間，也會(huì )使脫色劑滲透進(jìn)陽(yáng)性菌的細胞壁中，使染上的結晶紫脫去顏色，最后染上復紅的顏色，變成革蘭陰性菌。而脫色時(shí)間太短又會(huì )使陰性菌染上的結晶紫不能完全脫色，出現紫色，誤認為革蘭陽(yáng)性菌。

  洗脫時(shí)間應當嚴格控制在20 s-30 s之間，同時(shí)保證洗脫效果，如果操作過(guò)程中，洗脫了30 s，還有紫色物質(zhì)流出，那么應該根據實(shí)際情況繼續沖洗，直至不再流出紫色物質(zhì)為止。應根據季節、氣溫調整染色和脫色時(shí)間，一般冬季時(shí)間可稍微長(cháng)些，夏季可稍微短些”。

（5）對照的設置

  大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的革蘭氏陰性和陽(yáng)性特征已經(jīng)被廣泛研究，因此可以用作標準對照菌株，在革蘭氏染色實(shí)驗中進(jìn)行結果驗證。

  在用革蘭氏染色方法鑒定一個(gè)未知菌株時(shí)，采用大腸桿菌和枯草芽孢桿菌這兩種已知的對照菌株同時(shí)染色對比，能夠保證革蘭氏染色實(shí)驗的準確性和可重復性，也可以根據情況選用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為對照�？傊�，對于不經(jīng)常進(jìn)行本實(shí)驗的操作人員，每次設置對照同時(shí)進(jìn)行染色操作尤為必要。

三、注意事項

  綜上所述，試劑的質(zhì)量、培養基的組成、菌齡、直接的染色操作等，都能影響細菌的染色，還有菌體細胞的構造和其外膜的通透性，如細胞膜的通透性、膜孔的大小和細胞結構完整與否，在染色上都起一定作用。所以我們在染色時(shí)要注意當染色結果與預想的結果出現不一致時(shí)，要充分考慮到這些因素的影響。同時(shí)試驗操作時(shí)，養成良好的學(xué)習態(tài)度，嚴格按照操作規程來(lái)做，提高實(shí)驗結果的準確性。

  在整個(gè)革蘭氏染色過(guò)程中，在保證試劑有效的前提下，需要嚴格控制的幾個(gè)方面：染色菌必須是在其活躍期內，涂布狀態(tài)不可太厚，嚴格控制初染、媒染時(shí)間和脫色時(shí)間，并保證洗脫效果。為了更準確判斷試驗結果，應該分別設置陽(yáng)性對照和陰性對照菌，與待鑒定菌種同時(shí)進(jìn)行染色，對比觀(guān)察試驗結果。

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