質(zhì)粒設計對目的基因表達的影響

影響外源DNA轉錄的主要因素是啟動(dòng)子的強弱。啟動(dòng)子是DNA序列中與宿主細胞的RNA聚合酶專(zhuān)一結合并起始轉錄合成mRNA的部位。大多數外源的特別是真核細胞的啟動(dòng)子不能被大腸桿菌RNA聚合酶識別，因此必須將外源基因置于大腸桿菌啟動(dòng)子控制下。Lac、LacUV5、Tac等都是常用的強啟動(dòng)子。但是太強的啟動(dòng)子在啟動(dòng)外源基因表達時(shí)可能?chē)乐負p害重組菌的正常生長(cháng)代謝，因而需要選擇合適的啟動(dòng)子。轉錄終止信號也會(huì )影響轉錄，人工合成的基因一定要裝配合適的終止子，以減少能量消耗及保持轉錄的準確性。

翻譯水平影響外源基因表達的重要因素是翻譯起始區。翻譯是在核糖體上進(jìn)行的，因此mRNA上必須有核糖體的結合部位（稱(chēng)SD序列）。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，同一種氨基酸可以有不同的密碼子翻譯得到，每種宿主細胞都有其偏愛(ài)的密碼子，對于人工合成基因來(lái)說(shuō)，應該對密碼子進(jìn)行優(yōu)化，采用宿主菌偏愛(ài)密碼子代替稀有密碼子，同時(shí)保持嘌呤和嘧啶堿基配對反應的能量平衡。翻譯后的加工修飾也將影響表達水平，包括切除新生肽鍵N端甲酰蛋氨酸、形成二硫鍵、糖基化和肽鍵本身的后加工等。

在基因工程誕生后研究開(kāi)發(fā)第一代重組DNA產(chǎn)品時(shí)，發(fā)現在大腸桿菌細胞內表達的胰島素的產(chǎn)量很低。經(jīng)過(guò)深入研究，發(fā)現這些表達的蛋白質(zhì)大部分都被細胞內蛋白酶降解了。但當目標產(chǎn)物與β-半乳糖苷酶融合表達時(shí)，不會(huì )被蛋白酶降解，使融合蛋白產(chǎn)物能在細胞內高水平積累，從而產(chǎn)生了目的基因高效融合表達的新方法。融合表達的蛋白質(zhì)沒(méi)有生物活性，但在質(zhì)粒設計時(shí)已經(jīng)預先考慮了酶切或化學(xué)方法的切割位點(diǎn)，可以很容易地將融合的一段肽鏈切除后恢復目標蛋白的活性。該方法的表達產(chǎn)量高，已得到了廣泛應用。

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