抗生素的基本篩選方法

  自從發(fā)現青霉素后，各國科學(xué)家已經(jīng)對發(fā)現新抗生素建立了一套比較系統的方法，可以在短時(shí)間內從微生物的次級代謝產(chǎn)物中發(fā)現數以千計的活性分子，從中又能夠進(jìn)一步篩選出幾個(gè)具有臨床應用價(jià)值的抗生素。這種篩選方法最初是由美國Rutgers大學(xué)的Waksman教授于1940年建立起來(lái)的，至今仍然被工業(yè)界和學(xué)術(shù)界廣泛采用。

  在上一節中我們已經(jīng)介紹了許多抗生素生產(chǎn)菌都是來(lái)自于有機物在自然界的循環(huán)過(guò)程，因此篩選的第一步是收集各種環(huán)境條件下的土壤和腐敗植物樣品，從中進(jìn)行篩選。最常用的篩選過(guò)程包括如下步驟：①將土壤樣品加水后充分攪拌或震蕩；②離心取上清液并稀釋后涂在事先準備好的瓊脂平板上；③在平板上挑選一些菌落接種于液體培養基進(jìn)行培養；④吸取培養液檢驗其抗菌或其他生物活性。

  當某一菌落的生物活性得到確證后，就必須將生物活性物質(zhì)進(jìn)行分離和部分提純，以確定該物質(zhì)是否具有新穎性，并進(jìn)行一系列初步的生物試驗以評價(jià)其應用前景。這一步驟的關(guān)鍵是要避免與前人工作的重復。一般而言，培養液中生物活性物質(zhì)的濃度很低，而且存在許多結構類(lèi)似物，若要完全將它們分別予以提純將需要消耗大量的人力和物力。因此對代謝產(chǎn)物的提純要適度，粗產(chǎn)物的純度應該在5%～10%以上。在分離前應該確定活性物質(zhì)是在發(fā)酵液中還是菌體中。

  確定活性物質(zhì)的新穎性是篩選工作的重點(diǎn)，為此要對活性物質(zhì)進(jìn)行一系列的生物學(xué)性質(zhì)和物理化學(xué)性質(zhì)檢驗。主要的生物學(xué)性質(zhì)有：①對活性物質(zhì)的抗菌譜進(jìn)行評價(jià)，包括交叉抗菌譜，血清、pH、接種量及離子等因素對抗菌譜的影響；②活性物質(zhì)對實(shí)驗動(dòng)物的影響，特別是對已受到感染的動(dòng)物鼠的ED50（50%有效劑量）和LD50（50%致死劑量）的測定，除了確定其絕對值外，有效劑量和致死劑量的相對比值具有更重要的意義，因為經(jīng)初步提純的活性物質(zhì)中，雖然純度不高，但如果活性物質(zhì)只有一種，該比值就與樣品的純度無(wú)關(guān)；③如果產(chǎn)物是某一特定代謝途經(jīng)中某一種酶的抑制劑，鑒別其新穎性就比較容易，因為需要比較的對象只是具有同樣功能的數量有限的幾種化合物，當然也要注意該化合物是否在過(guò)去已經(jīng)根據它的其他活性而被分離、鑒別過(guò)。

  由于產(chǎn)物只經(jīng)過(guò)初步的分離提純，還不可能進(jìn)行純物質(zhì)物性的測定，如熔點(diǎn)、紅外及NMR譜等，但是可以進(jìn)行紫外和可見(jiàn)光譜的測量，從中可以獲得許多有用的信息。樣品雖然不純，但活性物質(zhì)的含量往往是最多的，因此利用質(zhì)譜可以測定其正確的分子量，這對于新穎性的鑒別非常有用。在各種溶劑系統中進(jìn)行紙層析和薄層層析能獲得該物質(zhì)的酸堿性、親水或親脂性等性質(zhì)，斑點(diǎn)的遷移值可以用來(lái)與已知數據比較�，F代HPLC技術(shù)既可以用于分離也可以鑒定有關(guān)物質(zhì)，如：毛細管色譜可以達到很高的理論板數，因此有很好的分離效果。從紫外掃描得到的譜圖可以與已知譜圖比較以確定其新穎性，半制備色譜能提供一定數量的純物質(zhì)供進(jìn)一步的生物活性鑒定。

  為了確定新發(fā)現的生物活性物質(zhì)是否具有新穎性，需要建立一個(gè)所有已知抗生素的數據庫，如Bioactive Natural Product Database（BNPD）。如果確實(shí)發(fā)現了一個(gè)具有特殊結構又具有特殊生物活性的新化合物，就需要將它提純并精確測定其物理化學(xué)性質(zhì)和化學(xué)結構。與此同時(shí)，可以考慮申請專(zhuān)利以保護知識產(chǎn)權。

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