探討藥品微生物限度檢查中的誤差影響因素及改進(jìn)措施

  藥品微生物限度檢查(以下簡(jiǎn)稱(chēng)微限)的目的是確定藥品(含原料及輔料)是否污染微生物或其污染微生物的程度，將微生物的種類(lèi)和數量限制在一定的范圍之內或者不得檢出，是保證用藥的有效性、保障藥品安全性的重要措施。也是衡量藥品生產(chǎn)，流通以及使用全過(guò)程微生物控制水平的主要依據之一�？茖W(xué)技術(shù)的進(jìn)步，藥品生產(chǎn)工藝的提高以及人民對藥品安全理念的不斷提升，促使藥品檢驗標準不斷提高，微生物限度檢查作為藥品質(zhì)量的安全性評價(jià)指標也不例外。我國的首版藥典于1953年出版，但開(kāi)展藥品微生物污染檢查工作始于1972年，《中國藥典》(1995年版)初次收載了微生物限度檢查法，2000年版首次收載了微生物限度標準，2015年版形成了較為完善的藥品微生物控制標準體系，并解決了基本與美國藥典等國際人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調會(huì )(ICH)方案接軌�！吨袊�藥典》(2020年版)進(jìn)一步促進(jìn)了藥品微生物實(shí)驗室的管理與國際接軌，實(shí)現了微限檢查由最終產(chǎn)品檢驗向過(guò)程控制的改變。為了提升藥品微生物實(shí)驗室的檢驗能力，選取了2019年1月至2020年12月期間實(shí)驗室微限檢查結果作為樣本，對微限檢查誤差來(lái)源進(jìn)行回顧性梳理，以期減少或避免誤差出現的概率，保證微限檢查結果的準確性。

1 資料與方法

  1.1 資料

  選取2019年1月-2020年12月，本實(shí)驗室承擔的藥品微限檢查共870批，其中片劑372批、丸劑187批、顆粒劑227批、口服液84批。對研究藥品微限檢查誤差的相關(guān)文獻進(jìn)行檢索，并分類(lèi)整理。

  1.2 方法 

  按照標準對870批藥品進(jìn)行微限檢查，記錄發(fā)生誤差的情況，分析誤差產(chǎn)生的來(lái)源并對檢驗中出現的誤差進(jìn)行統計，采用Microsoft Office Excel 2007進(jìn)行整理分析，以回顧性分析的方法探究出現誤差的影響因素，了解其分布情況。同時(shí)對比文獻研究數據，觀(guān)察本實(shí)驗室與其他地市級藥品檢驗機構的差異，以期在未來(lái)的工作中減少誤差發(fā)生率。

2 結果

  對上述870批藥品微限檢查的統計結果顯示，有42批次(4.8%)因受到操作環(huán)境、供試液制備等因素影響導致檢驗結果出現偏差。影響因素、誤差例數及占比情況見(jiàn)表1。

  通過(guò)中國知網(wǎng)數據庫查閱文獻資料，選取部分高同質(zhì)性的藥品檢驗機構微生物實(shí)驗室的文獻資料，研究統計并進(jìn)行綜合分析，共1180例誤差數據，詳見(jiàn)表2。

  表1和表2對比情況見(jiàn)圖1�？梢钥闯�，藥品微限檢查誤差中，影響因素主要來(lái)自六個(gè)方面，其中供試液制備時(shí)出現誤差比例最高，其次是培養基，另外依次是檢驗設備及用具、操作環(huán)境、菌落計數和藥品自身性質(zhì)。本實(shí)驗室和其他地市實(shí)驗室統計結果基本一致。

圖1本實(shí)驗室與其他地市藥檢機構誤差影響因素所占比例對比圖

3 誤差影響因素的分析及探討

  藥品微限檢查目前最常用的方法是生物學(xué)檢驗技術(shù)，該技術(shù)操作程序較為繁瑣、檢驗流程要求緊密?chē)栏�，檢驗周期較長(cháng)，導致出現干擾因素的環(huán)節較多，容易導致檢驗結果出現誤差。因此，總結分析誤差影響因素，在今后的檢驗工作中給予充分關(guān)注，可以減少誤差出現的概率，保證檢驗結果的準確性與可靠性。

  3.1 供試液制備

  供試液制備是誤差發(fā)生的主要因素，該工作目前主要由檢驗人員完成，沒(méi)有自動(dòng)化儀器設備可以替代。因此，檢驗人員的專(zhuān)業(yè)素養、理論知識、操作技能和工作經(jīng)驗是嚴格規范操作、保證結果準確性的基礎。

  供試液制備時(shí)應保證樣品的真實(shí)污染狀態(tài)，既不能殺死樣品本身污染的微生物，也不能污染樣品，還要避免操作不當導致樣品污染實(shí)驗環(huán)境。要通過(guò)方法適用性檢查，保證供試液不具有或者消除其殺菌及抑菌活性。在注皿之前，應保證樣品分散均勻，避免吸取供試液的沉淀物或上清液造成結果偏離。為防止細菌增殖，制備過(guò)程要穩、準、快，從供試液制備到傾注培養基整個(gè)操作過(guò)程應嚴格控制在1小時(shí)內，避免時(shí)間過(guò)長(cháng)對檢驗結果造成影響。

  鑒于藥檢機構成立時(shí)間早，人員更新慢，專(zhuān)業(yè)結構不合理，人員老化較為嚴重，現有工作人員大部分經(jīng)歷了多版藥典的實(shí)施。有些人員學(xué)習能力較差，學(xué)習意識淡泊，不能及時(shí)跟進(jìn)檢驗標準的變化，不能有效理解新版藥典微限檢查的操作要求，容易在操作中出現失誤，最終導致出現錯誤的結果。主要表現在以下幾個(gè)方面：一是有些藥檢機構認為微限檢查不使用大型精密儀器，檢驗方法較為單一，對人員和技術(shù)要求不高。在人員配置時(shí)將非微生物學(xué)專(zhuān)業(yè)畢業(yè)的人員、無(wú)相關(guān)微限檢查工作經(jīng)歷的人員安排到微限檢查崗位； 二是藥檢機構中相比較于理化檢驗人員，微限檢查人員較少，考慮到培訓成本，“請進(jìn)來(lái)”的培訓幾乎沒(méi)有。除了技術(shù)骨干極少的外出培訓機會(huì )，大多靠檢驗人員自學(xué)，學(xué)習的自覺(jué)性、學(xué)習的效果均難以追蹤考核； 三是上崗考核流于形式。對于新進(jìn)人員或者轉崗人員，上崗考試基本以筆試為主，形式大于內容，對操作技能重視不夠。

  3.2 培養基

  培養基是微生物檢驗的基礎，直接影響微生物檢驗結果。目前，大部分實(shí)驗室使用商品化培養基，收到培養基后應對品名、批號、生產(chǎn)廠(chǎng)家及有效期等進(jìn)行初步驗收，使用前應進(jìn)行適用性檢查，適用性檢查符合要求方可使用。開(kāi)瓶時(shí)應注明開(kāi)瓶日期和經(jīng)驗證的有效期，一旦發(fā)現受潮結塊等現象，應立即停止使用。使用時(shí)應按標簽標識的說(shuō)明進(jìn)行配制，配制時(shí)應充分溶解，一般采用濕熱滅菌法。為保證滅菌時(shí)既不破壞有效成分，又要保證滅菌徹底，需按照經(jīng)驗證的滅菌條件操作。應確定每批培養基滅菌后的pH值的范圍(冷卻至25℃左右測定)，溫度過(guò)高測定pH值時(shí)顏色反應可能有誤差。滅菌后的培養基pH值如果測定時(shí)超出范圍，不便調整。因此，建議實(shí)驗室在滅菌前測定培養基pH值，一旦超出范圍，應緩慢滴加適宜的堿液或者酸液進(jìn)行調整，添加過(guò)量導致再矯正時(shí)，培養基的靈敏性可能降低，影響菌落生長(cháng)。

  陳曉燕指出滅菌后的培養基可以在2～8℃放置60天，但因為各實(shí)驗室溫度、相對濕度、冰箱性能等控制條件有差異，如要延長(cháng)保存時(shí)間，需要在本實(shí)驗室開(kāi)展驗證。因此，建議臨用新制，避免培養基保存期間導致的促生長(cháng)能力、抑制能力及指示特性下降。

  3.3 檢驗設備及用具 

  儀器設備應定期進(jìn)行檢定/校準，不得使用超過(guò)檢定/校準周期的儀器設備。儀器設備運行期間，應嚴格按照維護計劃執行，以保持良好的工作狀態(tài)。影響實(shí)驗結果準確性的關(guān)鍵設備有高壓滅菌器、冰箱以及培養箱，在運行過(guò)程中對溫度、壓力等關(guān)鍵參數要連續觀(guān)測，并做好記錄，尤其是高壓鍋，遇到儀器出現故障時(shí)要及時(shí)發(fā)現并處置，避免出現意外傷害事故。本實(shí)驗室曾有一臺高壓滅菌器在達到滅菌條件和滅菌時(shí)間后，仍然保持高溫高壓，為防止意外，只能強制斷電中止設備運行，本次滅菌的培養基作廢棄物處理。

  檢驗中用到的玻璃儀器等用具均需進(jìn)行滅菌，目前大部分實(shí)驗室改用一次性無(wú)菌培養皿，省去了培養皿清潔和滅菌的繁瑣。但使用一次性無(wú)菌培養皿前，尤其在更換生產(chǎn)廠(chǎng)家后，應注意驗收，可選用少量與庫存培養皿進(jìn)行對比試驗。本實(shí)驗室曾在某次實(shí)驗時(shí)出現多批不同品種樣品菌落數超標，同時(shí)陰性對照有菌落生長(cháng)，當次實(shí)驗結果全部作廢。啟動(dòng)偏差調查，經(jīng)回顧性分析和反復討論，考慮是新到貨培養皿的問(wèn)題。使用原庫存的培養皿進(jìn)行對比驗證后，確認是培養皿不合格，隨即聯(lián)系供應部門(mén)對該批次培養皿進(jìn)行了退換，同時(shí)建議供應部門(mén)加強對供應商的評估。

  3.4 操作環(huán)境

  為降低或避免交叉污染，微限檢查應在不低于D級背景下的生物安全柜或B級潔凈區域內進(jìn)行，且操作區域內應為單向流空氣。為保持環(huán)境的適宜性和有效性，年初應制定環(huán)境監測計劃，定期監測浮游菌、沉降菌、壓差等重要參數�？照{潔凈系統長(cháng)時(shí)間運行后，初效、高效過(guò)濾網(wǎng)更換不及時(shí)，會(huì )有潔凈度不符合要求的風(fēng)險。檢驗人員應具有無(wú)菌意識，將無(wú)菌觀(guān)念銘記在心，落實(shí)在細節處。

  檢驗前要做好充分的準備工作，將所需物品全部放進(jìn)無(wú)菌室，檢驗過(guò)程中嚴禁進(jìn)出實(shí)驗室取用實(shí)驗用品。在無(wú)菌室內檢驗用具要保存在固定位置，杜絕隨意移動(dòng)，無(wú)關(guān)物品禁止入內。生物安全柜應保持臺面清潔，使用前按規定進(jìn)行消毒，還要定期委托有資質(zhì)的第三方實(shí)驗室進(jìn)行校準，對濾網(wǎng)等關(guān)鍵配件要定期清理或更換。實(shí)驗中人員是潔凈室內主要的發(fā)塵源，單位面積內人員越多，對實(shí)驗環(huán)境影響越大，實(shí)驗結果的可信度越差。因此，實(shí)驗時(shí)無(wú)關(guān)人員禁止入內，同時(shí)檢驗操作應平穩有序，嚴禁人員頻繁走動(dòng)、接打電話(huà)，以避免攪動(dòng)空氣中的塵埃粒子，影響檢驗結果。

  3.5 菌落計數 

  菌落計數方法首先要考慮方法的選擇及確認。一般首選操作過(guò)程簡(jiǎn)單的方法，常用的是低稀釋級(1∶10稀釋液)平皿傾注法，從而減少操作繁雜帶來(lái)誤差或者損傷微生物。其次選用增加稀釋倍數或培養基體積、添加中和劑或滅活劑等去除或滅活供試液的抗菌活性，再次選擇薄膜過(guò)濾法，或者上述幾種方法聯(lián)用。最可能數法因為精密度及準確度較差一般不選用。無(wú)論采取哪種方法，均要考慮所添加的表面活性劑、中和劑、滅活劑等試劑對微生物無(wú)毒性，同時(shí)確認所用試劑的相容性，避免發(fā)生反應影響檢驗結果。實(shí)驗中一定要進(jìn)行陰性對照試驗，在出現菌落生長(cháng)時(shí)，便于區分藥品自身情況還是操作環(huán)境等其他因素影響。

菌落計數時(shí)一般通過(guò)直接觀(guān)察，在平皿的背面進(jìn)行菌落計數，計數時(shí)應注意平皿邊緣生長(cháng)的菌落，同時(shí)注意區分菌落和顆粒物、膠囊殼碎片等，可借助放大鏡、低倍顯微鏡觀(guān)察，必要時(shí)挑取可疑物進(jìn)行涂片鏡檢。

藥典中規定的有需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數、控制菌檢查。微生物廣泛存在于自然界中，藥品中污染微生物的種類(lèi)有可能不在其規定范圍內。出現不明菌落時(shí)，應進(jìn)行鑒定，確定污染的原因并及時(shí)采取預防措施。一旦確定是樣品自身原因，應立即上報監管部門(mén)，避免發(fā)生藥害事件。

  3.6 藥品自身性質(zhì)

  合格的藥品是生產(chǎn)出來(lái)的，不是檢驗出來(lái)的。在藥物生產(chǎn)、運輸、存儲過(guò)程中，都有可能會(huì )污染微生物。藥品的生產(chǎn)環(huán)境、工藝、設備、原料及輔料、質(zhì)量控制方法及水平和生產(chǎn)人員等均有可能帶來(lái)藥品微生物的污染。

  實(shí)驗室收到樣品后，首先應做好唯一性標識，避免樣品混淆，尤其針對三同樣品(同品種同廠(chǎng)家同批號)。應嚴格按照說(shuō)明書(shū)上記載的貯藏方式保存樣品，最大限度保持樣品原始狀態(tài)，避免樣品貯藏條件比如相對濕度過(guò)高、溫度過(guò)高等不符合要求導致的微生物污染。

  藥品中可能含有防腐劑，如果防腐劑未被中和或滅活，平板計數結果往往會(huì )受到影響，如低稀釋級菌落生長(cháng)數量較少，而高稀釋級菌落生長(cháng)數量反而增大，遇此情況應重復試驗，確定是藥品自身性質(zhì)影響還是操作技術(shù)造成的誤差。樣品的給藥途徑、抑菌程度等因素會(huì )影響檢驗方法的選擇，不同的檢驗方法又可能帶來(lái)不同的誤差來(lái)源。

4 討論及改進(jìn)措施

  針對誤差因素的分析，有條件的實(shí)驗室應配備微生物及相關(guān)專(zhuān)業(yè)畢業(yè)、有較高專(zhuān)業(yè)知識水平的人員。檢驗人員上崗前，必須進(jìn)行嚴格的崗前培訓，要熟練操作儀器設備，明確無(wú)菌操作要求，按規定制備培養基、潔凈室的消毒、培養基及廢棄物的滅菌、平板制作、菌落的計數方法、菌落的鑒定、菌種的保藏及傳代、潔凈室的微生物監測等。要對檢驗人員加強生物安全培訓，熟悉安全操作規范和滅菌消毒知識，保證自身安全的同時(shí)，也能有效防止實(shí)驗室被微生物污染。

  出現不合格結果時(shí)，應及時(shí)啟動(dòng)偏差調查，評估是樣品的原因還是實(shí)驗室誤差。積極參加外部組織的能力驗證等方式外，可在實(shí)驗室內部開(kāi)展盲樣檢測等活動(dòng)來(lái)考察檢驗技能和水平。當開(kāi)展新項目、使用新方法或新技術(shù)時(shí)，檢測開(kāi)始前對其操作技能要進(jìn)行專(zhuān)項評估確認。

  藥典中的微限檢查對象是活的微生物，而藥品中污染的微生物具有分布不均勻性。同一批次藥品可能部分被污染;被污染的藥品中，污染微生物的數量可能也不一致;被污染藥品微生物種類(lèi)可能比較復雜，也可能比較單一。微生物具有族團性，其大小及緊密程度具有遺傳性，族團的分化性差異極大，進(jìn)一步強化分布不均勻性。針對上述特點(diǎn)，抽樣時(shí)應嚴格遵守抽樣指導原則，保證樣品具有代表性。

  要強化檢驗人員對微限檢查全過(guò)程的質(zhì)量控制意識，做到以藥典指導原則為綱，落到細處，落到實(shí)處。建立本實(shí)驗室微限檢查的標準操作規程，使微限檢查逐步趨向規范化，標準化，既要防止假陽(yáng)性結果，更要避免假陰性結果，應客觀(guān)反映出藥品中微生物污染程度，確保檢驗結果的準確性，為藥品安全有效提供技術(shù)支撐。

來(lái)源：菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院 曹魯娜 畢言鋒 任仲麗 畢天琛 李懷偉 

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