萊氏無(wú)膽甾原體相關(guān)介紹

1、定義及特點(diǎn)

  萊氏無(wú)膽甾原體屬于支原體的一種，是最常見(jiàn)的污染細胞培養的支原體菌群之一。細胞培養中常見(jiàn)的支原體有口腔支原體、精氨酸支原體、萊氏無(wú)膽甾原體、豬鼻支原體、肺炎支原體和發(fā)酵支原體，其中前四者占據支原體污染的絕大比例，萊氏無(wú)膽甾原體為牛源性。

  支原體是一種大小介于細菌和病毒之間，并獨立生活的原核微生物，廣泛存在于人和動(dòng)物體內，只有個(gè)細胞膜而沒(méi)有細胞壁，它不容易受到β-內酰胺傳染，不被革蘭氏染液染色，單體呈現為多形態(tài)（呈現多種形狀，從球菌形到棒狀，到細絲），大小不一，從0.2μm到0.3μm或更小。萊氏無(wú)膽甾體被發(fā)現可以穿過(guò)0.2μm濾膜，但會(huì )被0.1μm過(guò)濾器截留，其一般會(huì )存在于動(dòng)物來(lái)源物料中，以及通常由動(dòng)物來(lái)源制備的微生物培養基中，支原體的環(huán)境監控需要采用選擇性培養基（PPLO肉湯或瓊脂）。

  大部分支原體繁殖速度比細菌慢，適宜生長(cháng)溫度為35℃，適合于偏堿條件下生存（pH7.6—8.0），對酸耐受性差，對75%乙醇、煤酚皂溶液敏感。對熱比較敏感在細胞培養過(guò)程中如果在顯微鏡下發(fā)現破碎的細胞很多，需要頻繁換液才能維持傳代培養的時(shí)候，即應懷疑支原體污染。

2、檢測及鑒定方法：

  （1）分離培養法

  支原體的病原學(xué)檢測主要是從被污染的細胞、雞胚中分離培養出支原體來(lái)確定，分離培養法是檢測支原體污染中最為可靠準確的方法。但是支原體對環(huán)境的影響敏感，容易被滅活，而且分離培養操作相對繁瑣，所需時(shí)間較長(cháng)，因此只能夠對支原體污染進(jìn)行定性觀(guān)察。分離培養法在常規的支原體檢測中多用于輔助其它檢測方法。

  （2）DNA熒光染色法

  DNA熒光染色法較分離培養法縮短了檢測周期，主要用于細胞培養中污染支原體的檢測。DNA熒光染色法正是利用熒光染色劑雙苯咪唑（Bisbenzimidzole）Hoechst33258能夠結合支原體DNA中的A-T堿基富集區域的原理，被支原體污染的細胞經(jīng)染色后，其細胞核外與細胞周?chē)�可看到許多大小均一的熒光點(diǎn)，即是富含A-T堿基區域的支原體DNA。

  （3）PCR技術(shù)

  PCR根據支原體基因組內的保守序列設計特異引物，對待檢樣品的核酸進(jìn)行擴增，通過(guò)對擴增產(chǎn)物的大小分析作出診斷。PCR檢測技術(shù)用于支原體污染的檢測，快速、靈敏、特異且簡(jiǎn)便，應用于科學(xué)研究和疾病的診斷。

  （4）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

  ELISA用于支原體污染的檢測中，有著(zhù)良好的特異性和敏感性，一次可以完成大量樣品的檢測。

  （5）電鏡

  一般在細胞培養48～72小時(shí)，細胞接近匯合前，用胰酶消化細胞制成細胞懸液后進(jìn)行固定、包埋、切片后才能進(jìn)行觀(guān)察。

  （6）定期檢測

  支原體感染會(huì )使培養細胞慢慢枯萎，因此對培養細胞定期進(jìn)行支原體檢測非常重要。一般來(lái)說(shuō)每1至3個(gè)月就應該進(jìn)行一次支原體檢測。將定期支原體檢測常規化堅持下去，是細胞培養實(shí)驗室應對支原體感染的關(guān)鍵。

3、支原體污染的嚴重性

  （1）細胞外形可以沒(méi)有明顯的變化，支原體可以與細胞共存，污染后細胞液不會(huì )死亡，培養基一般不發(fā)生渾濁；

  （2）使用被支原體污染的細胞做實(shí)驗會(huì )嚴重影響實(shí)驗的結果，因為支原體會(huì )抑制細胞生長(cháng)；導致染色體畸變；細胞膜抗原性改變；細胞復蘇后存活率降低等。

  （3）影響細胞的代謝和功能：培液中的精氨酸被支原體大量消耗，引起細胞蛋白質(zhì)、DNA、rRNA、mRNA的合成障礙；支原體活動(dòng)使培液成分發(fā)生改變（如發(fā)酵型支原體降解糖類(lèi)產(chǎn)生酸性物質(zhì)），影響細胞代謝。

  （4）培養過(guò)程中細胞破碎較多，培養基pH變化明顯，需要頻繁更換新鮮培養基；

  （5）細胞被支原體污染后會(huì )形成共生體系導致污染不斷擴大。

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