艱難梭菌的活化與保存

一、艱難梭菌簡(jiǎn)介

  艱難梭菌（Clostridium difficile）一般指艱難梭狀芽孢桿菌，嚴格厭氧菌，對氧氣極為敏感，暴露在空氣中容易死亡，分離培養比較困難，因此起名為艱難梭菌。與產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、生孢梭菌同為梭狀芽孢桿菌屬，生長(cháng)條件接近，可在硫乙醇酸鹽流體培養基、庖肉培養基、血平板、哥倫比亞瓊脂等培養基上生長(cháng)（需嚴格厭氧培養），在紫外燈下有淡黃綠色熒光，不分解卵黃，不凝固牛奶。

二、活化方法

  1.硫乙醇酸鹽流體培養基：此培養無(wú)需厭氧設備即可培養艱難梭菌，購買(mǎi)的艱難梭菌若為凍干粉形式，可用0.1%蛋白胨水溶解后，接種至硫乙醇酸鹽流體培養基中36℃左右靜置培養24-48h，可觀(guān)察到艱難梭菌在氧化層以下生長(cháng)。

  注：艱難梭菌在硫乙醇酸鹽流體培養基中存活時(shí)間較短，觀(guān)察到艱難梭菌活化成功后，應在24h內盡快傳代或保存。

  2.庖肉培養基：配制時(shí)可在培養基表面覆蓋約7mm厚的液體石蠟隔絕空氣，滅菌后接種艱難梭菌，無(wú)需厭氧設備即可培養，36℃培養24-48h。

  3.血平板/哥倫比亞瓊脂：將艱難梭菌的凍干粉溶解后涂布至血平板或哥倫比亞瓊脂平板，迅速放入厭氧培養袋或厭氧培養箱中36℃培養24-48h，艱難梭菌呈淡黃色不規則菌落。

  注：艱難梭菌對氧氣極為敏感，因此操作時(shí)應盡可能在厭氧操作中進(jìn)行，若在空氣中操作，應快速進(jìn)行，接種后立即轉入厭氧環(huán)境中培養基，減少氧氣的毒害作用。

三、實(shí)驗室保存及復蘇方法

  長(cháng)期保存：普通實(shí)驗室可使用甘油法或脫脂牛奶進(jìn)行超低溫冷凍保存，將培養好的艱難梭菌轉接至液體菌種保存管或脫脂牛奶菌種保存管中（盡可能挑取較多菌苔），用移液槍吹打分散均勻，置-80℃超低溫冰箱或液氮罐中冷凍保存，至少可存活兩年以上。復蘇時(shí)，取出菌種保存管，快速解凍，將菌液加入至硫乙醇酸鹽流體培養基/庖肉培養基或涂布至血平板/哥倫比亞瓊脂平板36℃厭氧培養24-48h。

  短期保存：將艱難梭菌活化至庖肉培養基中，置于2-8℃冰箱中冷藏保存，艱難梭菌可存活數月，活化時(shí)吸取少量菌液轉接至硫乙醇酸鹽流體培養基/庖肉培養基或涂布至血平板/哥倫比亞瓊脂平板36℃厭氧培養24-48h。

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