無(wú)乳鏈球菌檢驗標準操作程序

1 方法來(lái)源

  GB 4789.11-2014《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗β型溶血性鏈球菌檢驗》、DB46/T 280-2014《羅非魚(yú)鏈球菌病檢測技術(shù)規程》及文獻的方法。

2 適用范圍

  本程序規定了淡水魚(yú)及其養殖環(huán)境中無(wú)乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae的檢驗方法。

3 術(shù)語(yǔ)和定義

3.1 β型溶血

  在菌落周?chē)�形成完全透明的溶血環(huán)，紅細胞完全溶解。

3.2 β型溶血性鏈球菌

  能夠產(chǎn)生β型溶血的化膿（或A群）鏈球菌（Streptococcus pyogenes）和無(wú)乳（或B群）鏈球菌（Streptococcus agalactiae）。

4 培養基

  4.1 改良胰蛋白胨大豆肉湯（Modified tryptone soybean broth, mTSB）：見(jiàn)附錄A中A.1。

  4.2 哥倫比亞CNA血瓊脂(Columbia CNA blood agar)：見(jiàn)附錄A中A.2。

  4.3 哥倫比亞血瓊脂(Columbia blood agar)：見(jiàn)附錄A中A.3。

  4.4 革蘭氏染色液：見(jiàn)附錄A中A.4。

  4.5 胰蛋白胨大豆肉湯（Tryptone soybean broth, TSB）：見(jiàn)附錄A中A.5。

  4.6 草酸鉀血漿：見(jiàn)附錄A中A.6。

  4.7 0.25％氯化鈣(CaCl2)溶液：見(jiàn)附錄A中A.7。

  4.8 3％過(guò)氧化氫(H2O2)溶液：見(jiàn)附錄A中A.8。

第一法 無(wú)乳鏈球菌分離鑒定

本方法先檢測疑似β型溶血性鏈球菌，分離出的疑似β型溶血性鏈球菌菌株再根據生化檢測等進(jìn)一步鑒定是否為無(wú)乳鏈球菌。

6 檢驗程序

  無(wú)乳鏈球菌分離鑒定程序見(jiàn)圖1。

圖1 無(wú)乳鏈球菌分離鑒定程序

7 操作步驟

7.1 樣品的處理

  魚(yú)樣品：魚(yú)麻醉后，將待檢魚(yú)樣放置于干凈的解剖盤(pán)上，用75%酒精棉輕輕擦拭魚(yú)體表進(jìn)行消毒。用無(wú)菌剪刀和鑷子取魚(yú)的肝、脾、腎混合為一份樣品，背部肌肉為另一份樣品，按無(wú)菌操作分別稱(chēng)取檢樣25g，加入盛有225mL mTSB的均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)1min～2min；或加入盛有225mL mTSB的均質(zhì)杯中，以8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min。

  水體樣品：混勻后取500mL，用0.22μm濾膜過(guò)濾，將濾膜重懸于20mL mTSB，混勻。

  水底沉積物樣品：去除所有表層水后，混勻取25g，加入225mL mTSB，混勻。

7.2 增菌、分離

  將制備好的樣品放置在36℃±1℃培養18h～24h。

  將增菌液劃線(xiàn)接種于哥倫比亞CNA血瓊脂平板，36℃±1℃18h～24h，觀(guān)察菌落形態(tài)。

  β溶血性鏈球菌在哥倫比亞CNA血瓊脂平板上的典型菌落形態(tài)為直徑約2mm～3mm，灰白色、表面光滑突起、有乳光、圓形、邊緣整齊，并產(chǎn)生β溶血的菌落。注意部分菌株無(wú)β溶血環(huán)。

7.3 純培養

  挑取5個(gè)（如小于5個(gè)則全選）可疑菌落分別接種哥倫比亞血瓊脂平板和TSB增菌液，36℃±1℃培養18h～24h。

7.4 初步鑒定β型溶血性鏈球菌

  7.4.1 革蘭氏染色鏡檢

  挑取可疑菌落染色鏡檢。β型溶血性鏈球菌為革蘭氏染色陽(yáng)性，球形或卵圓形，常排列成短鏈狀。

  7.4.2 觸酶試驗

  挑取可疑菌落于潔凈的載玻片上，滴加適量3%過(guò)氧化氫（H₂O₂）溶液，立即產(chǎn)生氣泡者為陽(yáng)性。β型溶血性鏈球菌觸酶試驗為陰性。

  7.4.3 鏈激酶試驗（選做）

  吸取草酸鉀血漿0.2mL于0.8mL滅菌生理鹽水中混勻，再加入經(jīng)36℃±1℃培養18h～24h的可疑菌的TSB培養液0.5mL及0.25%氯化鈣（CaCl₂）0.25mL，振蕩搖勻，置于36℃±1℃水浴中10min，血漿混合物自行凝固（凝固程度至試管倒置，內容物不流動(dòng)）。繼續36℃±1℃培養24h，凝固塊重新完全溶解為陽(yáng)性，不溶解為陰性，β型溶血性鏈球菌為陽(yáng)性。

7.5 鑒定無(wú)乳鏈球菌

  根據7.4結果符合β型溶血性鏈球菌特征的菌株可采用下列任一種方法進(jìn)一步確定是否為無(wú)乳鏈球菌。

  7.5.1 生化鑒定

  采用生化鑒定試劑盒或生化鑒定卡，如API 20 STREP或VITEK鑒定卡進(jìn)一步確定是否為無(wú)乳鏈球菌。

  7.5.1.1 無(wú)乳鏈球菌部分生化試驗：觸酶試驗陰性，分解海藻糖，不分解山梨醇，馬尿酸鈉、CAMP和VP試驗均為陽(yáng)性，七葉苷和6.5%NaCl試驗均為陰性。

  7.5.1.2 無(wú)乳鏈球菌傳統生化鑒別要點(diǎn)：

  1）本菌特征革蘭陽(yáng)性球菌，菌落較小，β溶血環(huán)、觸酶試驗陰性，CAMP試驗陽(yáng)性。

  2）與其他溶血鏈球菌的鑒別

附錄A培養基和試劑

A.1 改良胰蛋白胨大豆肉湯培養基(Modified tryptone soybean broth, mTSB)

  A.1.1 基礎培養基(胰蛋白胨大豆肉湯TSB)

  A.1.1.1 成分

胰蛋白胨	17.0g
大豆蛋白胨	3.0g
氯化鈉	5.0g
磷酸二氫鉀（無(wú)水）	2.5g
葡萄糖	2.5g
蒸餾水	1000.0mL

  A.1.1.2 制法

  將A.1.1.1中各成分溶于蒸餾水中，加熱溶解，校正pH至7.3±0.2，121 ℃滅菌15min，備用。

  A.1.2 抗生素溶液

  A.1.2.1 多黏菌素溶液

  稱(chēng)取10mg多黏菌素B于10mL滅菌蒸餾水中，振搖混勻,充分溶解后過(guò)濾除菌。

  A.1.2.2 萘啶酮酸鈉溶液

  稱(chēng)取10 mg萘啶酮酸于10mL 0.05mol/L氫氧化鈉溶液中，振搖混勻,充分溶解后過(guò)濾除菌。

  A.1.3 完全培養基

  A.1.3.1 成分

胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)	1000.0mL
多黏菌素溶液	10.0mL
萘啶酮酸鈉溶液	10.0mL

  A.1.3.2 制法

  無(wú)菌條件下，將A.1.3.1中各成分進(jìn)行混合，充分混勻，分裝備用。

相關(guān)產(chǎn)品：

改良胰蛋白胨大豆肉湯培養基（mTSB）-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情

多粘菌素B-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情

萘啶酮酸2.25mg-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情

A.2 哥倫比亞CNA血瓊脂(Columbia CNA blood agar)

  A.2.1 成分

胰酪蛋白胨	12.0g
動(dòng)物組織蛋白消化液	5.0g
酵母提取物	3.0g
牛肉提取物	3.0g
玉米淀粉	1.0g
氯化鈉	5.0g
瓊脂	13.5g
多黏菌素	0.01g
萘啶酸	0.01g
蒸餾水	1000.0mL

  A.2.2 制法

  將A.2.1中各成分溶于蒸餾水中，加熱溶解，校正pH至7.3±0.2，121 ℃滅菌12min，待冷卻至50℃左右時(shí)加50mL；無(wú)菌脫纖維綿羊血，搖勻后倒平板。

相關(guān)產(chǎn)品：

哥倫比亞CNA血瓊脂-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情

A.3 哥倫比亞血瓊脂(Columbia blood agar)

  A.3.1 基礎培養基

  A.3.1.1 成分

動(dòng)物組織酶解物	23.0g
淀粉	1.0g
氯化鈉	5.0g
瓊脂	8.0g～18.0g
蒸餾水	1000.0mL

  A.3.1.2 制法

  將基礎培養基成分溶解于蒸餾水中，加熱促其溶解。121℃高壓滅菌15min。

  A.3.2 無(wú)菌脫纖維綿羊血

  無(wú)菌操作條件下，將綿羊血加入到盛有滅菌玻璃珠的容器中，振搖約10min，靜置后除去附有血纖維的玻璃珠即可。

  A.3.3 完全培養基

  A.3.3.1 組分

基礎培養基	1000.0mL
無(wú)菌脫纖維綿羊血	50.0mL

  A.3.3.2 制法

  當基礎培養基的溫度為45℃左右時(shí)，無(wú)菌加入綿羊血，混勻。校正pH至7.2±0.2。傾注15mL于無(wú)菌平皿中，靜置至培養基凝固。使用前需預先干燥平板。預先制備的平板未干燥時(shí)在室溫放置不得超過(guò)4h，或在4℃冷藏不得超過(guò)7d。

相關(guān)產(chǎn)品：

哥倫比亞血瓊脂基礎-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情

脫纖維羊血-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情

A.4 革蘭氏染色液

  A.4.1 結晶紫染色液基礎培養基

  A.4.1.1 成分

結晶紫	1.0g
95％乙醇	20.0mL
1％草酸銨水溶液	80.0mL

  A.4.1.2 制法

  將結晶紫完全溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。

  A.4.2 革蘭氏碘液

  A.4.2.1 成分

碘	1.0g
碘化鉀	2.0g
蒸餾水	300.0mL

  A.4.2.2 制法

  將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合，加入蒸餾水少許充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300mL。

  A.4.3 沙黃復染液

  A.4.3.1 成分

沙黃	0.25g
95％乙醇	10.0mL
蒸餾水	90.0mL

  A.4.3.2 制法

  將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。

  A.4.4 染色操作步驟

  將涂片在酒精燈火焰上固定，滴加結晶紫染色液，染1min，水洗；滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗；滴加95％乙醇脫色，約15s～30s，直至染色液被洗掉，不要過(guò)分脫色，水洗；滴加復染液，復染1min，水洗后進(jìn)行干燥，鏡檢。

相關(guān)產(chǎn)品：

革蘭氏染色液試劑盒-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情

A.5 胰蛋白胨大豆肉湯Tryptone soybean broth, TSB

  A.5.1 成分

胰蛋白胨	17.0g
氯化鈉	5.0g
大豆蛋白胨	3.0g
磷酸二氫鉀（無(wú)水）	2.5g
葡萄糖	2.5g
蒸餾水	1000.0mL

  A.5.2 制法

  將A.5.1中各成分溶于蒸餾水中，加熱溶解，校正pH至7.3±0.2，121℃滅菌15min，分裝備用。

相關(guān)產(chǎn)品：

胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情

A.6 草酸鉀血漿

  A.6.1 成分

草酸鉀	0.01g
人血	5.0mL

  A.6.2 制法

  草酸鉀0.01g放入滅菌小試管中，再加入5mL人血，混勻，經(jīng)離心沉淀，吸取上清液即為草酸鉀血漿。

相關(guān)產(chǎn)品：

凍干草酸鉀兔血漿-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情

A.7 0.25％氯化鈣(CaCl₂)溶液

  A.7.1 成分

氯化鈣（無(wú)水）	22.2g
蒸餾水	1000.0mL

  A.7.2 制法

  稱(chēng)取22.2g氯化鈣（無(wú)水）溶于蒸餾水中，分裝備用。

相關(guān)產(chǎn)品：

0.25%氯化鈣溶液-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情

A.8 3％過(guò)氧化氫(H₂O₂)溶液

  A.8.1 成分

30％過(guò)氧化氫(H2O2)溶液	100.0mL
蒸餾水	900.0mL

  A.8.2 制法

  吸取100mL 30％過(guò)氧化氫(H₂O₂)溶液，溶于蒸餾水中，混勻，分裝備用。

相關(guān)產(chǎn)品：

3%過(guò)氧化氫酶試劑-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情

 

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