植物組培培養基及其配制

   　培養基好比土壤，是組織培養中離體材料賴(lài)以生存和發(fā)展的基地。因此，在組織培養基的各個(gè)環(huán)節中，應著(zhù)重掌握培養基，了解它的組成和配制方法。
　　一、組成培養基的五類(lèi)成分
　　目前，大多數培養基的成分是由無(wú)機營(yíng)養物、碳源、維生素、生長(cháng)調節物質(zhì)和有機附加物等五類(lèi)物質(zhì)組成的。
　　1.無(wú)機營(yíng)養物
　　無(wú)機營(yíng)養物主要由大量元素和微量元素兩部分組成，大量元素中，氮源通常有硝態(tài)氮或銨態(tài)氮，但在培養基中用硝態(tài)氮的較多，也有將硝態(tài)氮和銨態(tài)氮混合使用的。磷和硫則常用磷酸鹽和硫酸鹽來(lái)提供。鉀是培養基中主要的陽(yáng)離子，在近代的培養基中，其數量有逐漸提高的趨勢。而鈣、鈉、鎂的需要則較少。培養基所需的鈉和氯化物，由鈣鹽、磷酸鹽或微量營(yíng)養物提供。微量元素包括碘、錳、鋅、鉬、銅、鈷和鐵。培養基中的鐵離子，大多以螯合鐵的形式存在，即FeSO4與Na2—EDTA(螯合劑)的混合。
　　2.碳源
　　培養的植物組織或細胞，它們的光合作用較弱。因此，需要在培養基中附加一些碳水化合物以供需要。培養基中的碳水化合物通常是蔗糖。蔗糖除作為培養基內的碳源和能源外，對維持培養基的滲透壓也起重要作用。
　　3.維生素
　　在培養基中加入維生素，常有利于外植體的發(fā)育。培養基中的維生素屬于B族維生素，其中效果最佳的有維生素B1、維生素B6、生物素、泛酸鈣和肌醇等。
　　4.有機附加物
　　包括人工合成或天然的有機附加物。最常用的有酪朊水解物、酵母提取物、椰子汁及各種氨基酸等。另外，瓊脂也是最常用的有機附加物，它主要是作為培養基的支持物，使培養基呈固體狀態(tài)，以利于各種外植體的培養。
　　5.生長(cháng)調節物質(zhì)
　　常用的生長(cháng)調節物質(zhì)大致包括以下三類(lèi)：
　　(1)植物生長(cháng)素類(lèi)。如吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。
　　(2)細胞分裂素。如玉米素(Zt)、6-芐基嘌呤(6-BA或BAP)和激動(dòng)素(Kt)。
　　(3)赤霉素。組織培養中使用的赤霉素只有一種，即赤霉酸(GA3)。
　　二、常用培養基配方及其特點(diǎn)
　　1.常用培養基配方
　　組織培養是否成功，在很大程度上取決于對培養基的選擇。不同培養基有不同特點(diǎn)，適合于不同的植物種類(lèi)和接種材料。開(kāi)展組織培養活動(dòng)時(shí)，應對各種培養基進(jìn)行了解和分析，以便能從中選擇使用。下面介紹組織培養幾種常用培養基的配方見(jiàn)表9－1。
　　培養基中的激素種類(lèi)和數量，隨著(zhù)不同培養階段和不同材料而有變化，因此各配方中均不列入。
　　2.幾種常用培養基的特點(diǎn)
(1) MS培養基。 MS培養基是目前普遍使用的培養基。它有較高的無(wú)機鹽濃度，對保證組織生長(cháng)所需的礦質(zhì)營(yíng)養和加速愈傷組織的生長(cháng)十分有利。由于配方中的離子濃度高，在配制、貯存、消毒等過(guò)程中，即使有些成分略有出入，也不致影響離子間的平衡。MS固體培養基可用來(lái)誘導愈傷組織，或用于胚、莖段、莖尖及花藥培養，它的液體培養基用于細胞懸浮培養時(shí)能獲得明顯成功。這種培養基中的無(wú)機養分的數量和比例比較合適，足以滿(mǎn)足植物細胞在營(yíng)養上和生理上的需要。因此，一般情況下，無(wú)須再添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有機附加成分。與其它培養基的基本成分相比，MS培養基中的硝酸鹽、鉀和銨的含量高，這是它的明顯特點(diǎn)。
　　(2)B5培養基。B5培養基的主要特點(diǎn)是含有較低的銨，這是因為銨可能對不少培養物的生長(cháng)有抑制作用。經(jīng)過(guò)試驗發(fā)現，有些植物的愈傷組織和懸浮培養物在MS培養基上生長(cháng)得比B5培養基上要好，而另一些植物，在B5培養基上更適宜。
　　(3)N6培養基。N6培養基特別適合于禾谷類(lèi)植物的花藥和花粉培養，在國內外得到廣泛應用。在組織培養中，經(jīng)常采用的還有懷特(While，1963)培養基、尼許(Nitsch，1951)培養基等。它們在基本成分上大同小異。懷特培養基由于無(wú)機鹽的數量比較低，更適合木本植物的組織培養。
三、培養液的配制
　　1.制備母液
　　為了避免每次配制培養基都要對幾十種化學(xué)藥品進(jìn)行稱(chēng)量，應該將培養基中的各種成分，按原量10倍、100倍或1000倍稱(chēng)量，配成濃縮液，這種濃縮液叫做母液。這樣，每次配制培養基時(shí)，取其總量的1/10、1/100、1/1000，加以稀釋?zhuān)�即成培養液�，F將培養液中各類(lèi)物質(zhì)制備母液的方法說(shuō)明如下。
　　(1)大量元素。大量元素包括硝酸銨等用量較大的幾種化合物。制備時(shí)，按表中排列的順序，以其10倍的用量，分別稱(chēng)出并進(jìn)行溶解，以后按順序混在一起，最后加蒸餾水，使其總量達到1升，此即大量元素母液。
　　(2)微量元素。因用量少，為稱(chēng)量方便和精確起見(jiàn)，應配成100倍或1000倍的母液。配制時(shí)，每種化合物的量加大100倍或1000倍，逐次溶解并混在一起，制成微量元素母液。
　　(3)鐵鹽。鐵鹽要單獨配制。由硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)5.57克和乙二胺四乙酸二鈉(Na—EDTA)7.45克溶于1升水中配成。每配1升培養基，加鐵鹽5毫升。
　　(4)有機物質(zhì)。主要指氨基酸和維生素類(lèi)物質(zhì)。它們都是分別稱(chēng)量，分別配成所需的濃度(0.1～1.0毫克/毫升)，用時(shí)按培養基配方中要求的量分別加入。
　　(5)植物激素。最常用的有生長(cháng)素和細胞分裂素。這類(lèi)物質(zhì)使用濃度很低，一般為0.01～10毫克/升�？砂从昧康�100倍或1000倍配制母液，配制時(shí)要單個(gè)稱(chēng)量，分別貯藏。
　　配制植物生長(cháng)素時(shí)，應先按要求濃度稱(chēng)好藥品，置于小燒杯或容量瓶中，用1～2毫升0.1N(克當量濃度)氫氧化鈉溶解，再加蒸餾水稀釋至所需濃度。配制細胞分裂素時(shí)，應先用少量0.5或1N的鹽酸溶解，然后加蒸餾水至所需量。
　　以上各種混合液(母液)或單獨配制藥品，均應放入冰箱中保存，以免變質(zhì)、長(cháng)霉。至于蔗糖、瓊脂等，可按配方中要求，隨稱(chēng)隨用。
　　2.配制培養基的具體操作
　�、俑鶕�配方要求，用量筒或移液管從每種母液中分別取出所需的用量，放入同一燒杯中，并用粗天平稱(chēng)取蔗糖、瓊脂放在一邊備用。
　�、趯ⅱ僦蟹Q(chēng)好的瓊脂加蒸餾水300～400毫升，加熱并不斷攪拌，直至煮沸溶解呈透明狀，再停止加熱。
　�、蹖ⅱ僦兴�取的各種物質(zhì)(包括蔗糖)，加入煮好的瓊脂中，再加水至1000毫升，攪拌均勻，配成培養基。
　�、苡�1N的氫氧化鈉或鹽酸，滴入③中的培養基里，每次只滴幾滴，滴后攪拌均勻，并用pH試紙測其pH值，直到將培養基的pH值調到5.8。
　�、輰⑴浜玫呐囵B基，用漏斗分裝到三角瓶(或試管)中，并用棉塞塞緊瓶口，瓶壁寫(xiě)上號碼。瓶中培養基的量約為容量的1/4或1/5。
培養基的成分比較復雜，為避免配制時(shí)忙亂而將一些成分漏掉，可以準備一份配制培養基的成分單，將培養基的全部成分和用量填寫(xiě)清楚。配制時(shí)，按表列內容順序，按項按量稱(chēng)取，就不會(huì )出現差錯。成分單的格式與內容見(jiàn)表9－2。
　　3.培養基的滅菌與保存
　　培養基配制完畢后，應立即滅菌。培養基通常應在高壓蒸汽滅菌鍋內，在汽相120℃條件下，滅菌20分鐘。如果沒(méi)有高壓蒸汽滅菌鍋，也可采用間歇滅菌法進(jìn)行滅菌，即將培養基煮沸10分鐘，24小時(shí)后再煮沸20分鐘，如此連續滅菌三次，即可達到完全滅菌的目的。
　　經(jīng)過(guò)滅菌的培養基應置于10℃下保存，特別是含有生長(cháng)調節物質(zhì)的培養基，在4～5℃低溫下保存要更好些。含吲哚乙酸或赤霉素的培養基，要在配制后的一周內使用完，其它培養基最多也不應超過(guò)一個(gè)月。在多數情況下，應在消毒后兩周內用完。

   

 

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