銅綠假單胞菌檢驗方法-化妝品安全技術(shù)規范(2022年版)

1.范圍

  本規范規定了化妝品中銅綠假單胞菌的檢驗方法。

  本規范適用于化妝品中銅綠假單胞菌的檢驗。

2.定義

  2.1銅綠假單胞菌 Pseudomonas aeruginosa

  屬于假單胞菌屬，為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陽(yáng)性，大部分能產(chǎn)生綠膿菌素。

3.儀器

  3.1 恒溫培養箱:36℃±1℃、42℃±1℃。

  3.2 三角瓶:250mL。

  3.3 試管:18 mm×150mm。

  3.4 滅菌平皿:直徑90mm。

  3.5 滅菌刻度吸管:10mL、 1mL。

  3.6 顯微鏡。

  3.7 載玻片。

  3.8 接種針、接種環(huán)。

  3.9 電磁爐。

  3.10 高壓滅菌器。

  3.11 恒溫水浴箱。

4.培養基和試劑

  4.1 SCDLP液體培養基

  見(jiàn)總則中3.2。

  4.2 十六烷基三甲基溴化銨培養基

  4.3 乙酰胺培養基

  制法:除瓊脂和酚紅外，將其他成分加到蒸餾水中，加熱溶解，調pH為7.2，加入瓊脂、酚紅，121℃高壓滅菌20min后，制成平板備用。

  4.4 綠膿菌素測定用培養基

  4.5 明膠培養基

  4.6 硝酸鹽蛋白胨水培養基

  制法:將蛋白胨和酵母浸膏加到蒸餾水中，加熱使之溶解，調pH為7.2，煮沸過(guò)濾后補足液量，加入硝酸鉀和亞硝酸鈉，溶解混勻，分裝到加有小倒管的試管中，115℃高壓滅菌20min后備用。

  4.7 普通瓊脂斜面培養基

5操作步驟

  5.1 增菌培養:取1:10檢液10mL加到90mL SCDLP液體培養基中,置36℃±1℃培養18h~24h。如有銅綠假單胞菌生長(cháng)，培養液表面多有一層薄菌膜，培養液常呈黃綠色或藍綠色。

  5.2 分離培養:將增菌后的培養物，劃線(xiàn)接種在十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板上，置36℃±1℃培養18h~24h。凡銅綠假單胞菌在此培養基上，其菌落扁平無(wú)定型，向周邊擴散或略有蔓延，表面濕潤，菌落呈灰白色，菌落周?chē)�培養基常擴散有水溶性色素。

  在缺乏十六烷三甲基溴化銨瓊脂時(shí)也可用乙酰胺培養基進(jìn)行分離,將增菌后的培養物劃線(xiàn)接種于平板上，置36℃±1℃培養24h±2h，銅綠假單胞菌在此培養基上生長(cháng)良好，菌落扁平，邊緣不整，菌落周?chē)�培養基呈紅色，其他菌不生長(cháng)。

  5.3 染色鏡檢:挑取可疑的菌落，涂片，革蘭氏染色（見(jiàn)耐熱大腸菌群檢驗方法4.5.2)，鏡檢為革蘭氏陰性者應進(jìn)行氧化酶試驗。

  5.4 氧化酶試驗:取一小塊潔凈的白色濾紙片置于滅菌平皿內，用無(wú)菌玻璃棒挑取銅綠假單胞菌可疑菌落涂在濾紙片上，然后在其上滴加一滴新配制的1%二鹽酸二甲基對苯二胺試液，在15s~30s之內，出現粉紅色或紫紅色時(shí)，為氧化酶試驗陽(yáng)性;若培養物不變色，為氧化酶試驗陰性。

  5.5 綠膿菌素試驗:取可疑菌落2個(gè)~3個(gè)，分別接種在綠膿菌素測定用培養基上，置36℃±1℃培養24h±2h，加入三氯甲烷3mL~5mL，充分振蕩使培養物中的綠膿菌素溶解于三氯甲烷液內，待三氯甲烷提取液呈藍色時(shí)，用吸管將三氯甲烷移到另一試管中并加入1mol/L的鹽酸1mL左右，振蕩后，靜置片刻。如上層鹽酸液內出現粉紅色到紫紅色時(shí)為陽(yáng)性，表示被檢物中有綠膿菌素存在。

  5.6 硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗:挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養物，接種在硝酸鹽胨水培養基中，置36℃±1℃培養 24h±2h，觀(guān)察結果。凡在硝酸鹽胨水培養基內的小倒管中有氣體者，即為陽(yáng)性，表明該菌能還原硝酸鹽，并將亞硝酸鹽分解產(chǎn)生氮氣。

  5.7 明膠液化試驗:挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養物，穿刺接種在明膠培養基內，置36℃±1℃培養24h±2h，取出放置于4℃±2℃冰箱10min~30min，如仍呈溶液狀或表面液化時(shí)即為明膠液化試驗陽(yáng)性;如凝固不溶者為陰性。

  5.8 42℃生長(cháng)試驗:挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養物，接種在普通瓊脂斜面培養基上，置于42℃±1℃培養箱中，培養24h~48h，銅綠假單胞菌能生長(cháng)，為陽(yáng)性，而近似的熒光假單胞菌則不能生長(cháng)。

6.檢驗結果報告

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