海博微信公眾號
海博天貓旗艦店
海博微信公眾號
海博天貓旗艦店
1.范圍
本規范規定了化妝品中耐熱大腸菌群的檢驗方法。
本規范適用于化妝品中耐熱大腸菌群的檢驗。
2.定義
2.1 耐熱大腸菌群 Thermotolerant coliform bacteria
系一群需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌，在44.5℃培養24h～48h能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。
該菌主要來(lái)自人和溫血動(dòng)物糞便，可作為糞便污染指標來(lái)評價(jià)化妝品的衛生質(zhì)量，推斷化妝品中有否污染腸道致病菌的可能。
3.儀器
3.1 恒溫水浴箱或隔水式恒溫箱:44.5℃±0.5℃。
3.2 溫度計。
3.3 顯微鏡。
3.4 載玻片。
3.5 接種環(huán)。
3.6 電磁爐。
3.7 三角瓶:250mL。
3.8 試管: 18 mm×150mm。
3.9 小倒管。
3.10 pH計或pH試紙。
3.11 高壓滅菌器。
3.12 滅菌刻度吸管:10mL、1mL。
3.13 滅菌平皿:直徑90mm。
4.培養基和試劑
4.1 雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）培養基
制法:將卵磷脂、吐溫80溶解到少量蒸餾水中。將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶解到其余的蒸餾水中，加到一起混勻，調pH為7.4，加入0.4%溴甲酚紫水溶液，混勻，分裝試管，每管10mL(每支試管中加一個(gè)小倒管）。115℃高壓滅菌20min。
成分:
蛋白胨
40g
豬膽鹽
10g
乳糖
10g
0.4%溴甲酚紫水溶液
5mL
卵磷脂
2g
吐溫80
14g
蒸餾水
1000mL
4.2 伊紅美藍（EMB）瓊脂
成分:
蛋白胨
10g
乳糖
10g
磷酸氫二鉀
2g
瓊脂
20g
2%伊紅水溶液
20mL
0.5%美藍水溶液
13mL
蒸餾水
1000mL
制法:先將瓊脂加到900mL蒸餾水中，加熱溶解，然后加入磷酸氫二鉀和蛋白胨，混勻，使之溶解。再以蒸餾水補足至1000mL。調pH值為7.2～7.4，分裝于三角瓶?jì)龋?21℃高壓滅菌15min備用。使用前將瓊脂融化，于每100mL瓊脂中無(wú)菌操作加入5mL滅菌的20%乳糖溶液、2mL2%伊紅水溶液和1.3mL 0.5%美藍水溶液，搖勻，冷至45℃～50℃，傾注平皿備用。
4.3 蛋白胨水（靛基質(zhì)試驗用)
制法:將上述成分加熱融化,調pH值為7.0～7.2,分裝小試管，121℃高壓滅菌15min。
成分:
蛋白胨（或胰蛋白胨)
20g
氯化鈉
5g
蒸餾水
1000mL
4.4 靛基質(zhì)試劑
柯凡克試劑:將5g對二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中,然后緩慢加入濃鹽酸25mL。
試驗方法:接種細菌于蛋白胨水中，于44.5℃土0.5℃培養24h±2h。沿管壁加柯凡克試劑0.3mL～0.5mL，輕搖試管。陽(yáng)性者于試劑層顯深玫瑰紅色。
注:蛋白胨應含有豐富的色氨酸,每批蛋白胨買(mǎi)來(lái)后,應先用已知菌種鑒定后方可使用。
4.5 革蘭氏染色液:
4.5.1 染液制備
4.5.1.1 結晶紫染色液:
將結晶紫溶于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。
成分:
結晶紫
1g
95%乙醇
20mL
1%草酸銨水溶液
80mL
4.5.1.2 革蘭氏碘液:
將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300mL。
成分:
碘
1g
碘化鉀
2g
蒸餾水加至
300mL
4.5.1.3 脫色液:95%乙醇。
4.5.1.4 復染液:
(1)沙黃復染液:
成分:
沙黃
0.25g
95%乙醇
10mL
蒸餾水
90mL
將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。
(2)稀石碳酸復紅液:稱(chēng)取堿性復紅10g，研細，加95%乙醇100mL，放置過(guò)夜，濾紙過(guò)濾。取該液10mL，加5%石碳酸水溶液90mL混合，即為石碳酸復紅液。再取此液10mL加水90mL，即為稀石碳酸復紅液。
4.5.2 染色法
4.5.2.1 將涂片在火焰上固定，滴加結晶紫染色液，染1min，水洗。
4.5.2.2 滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗。
4.5.2.3 滴加95%乙醇脫色，約30s，或將乙醇滴滿(mǎn)整個(gè)涂片，立即傾去，再用乙醇滴滿(mǎn)整個(gè)涂片，脫色10s，水洗。
4.5.2.4 滴加復染液，復染1min，水洗，待干，鏡檢。
4.5.3 染色結果
革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。
注:如用1:10稀釋石碳酸復紅染色液作復染，復染時(shí)間僅需10s。
5.操作步驟
5.1 取10mL 1:10稀釋的檢液，加到10mL雙倍乳糖膽鹽（含中和劑)培養基中，置44.5℃±0.5℃培養箱中培養24h±2h，如既不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，繼續培養至48h±2h，如仍既不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，則報告為耐熱大腸菌群陰性。
5.2 如產(chǎn)酸產(chǎn)氣，劃線(xiàn)接種到伊紅美藍瓊脂平板上，置36℃±1℃培養18h～24h。同時(shí)取該培養液1～2滴接種到蛋白胨水中，置44.5℃±0.5℃培養24h±2h。
經(jīng)培養后，在上述平板上觀(guān)察有無(wú)典型菌落生長(cháng)。耐熱大腸菌群在伊紅美藍瓊脂培養基上的典型菌落呈深紫黑色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，常具有金屬光澤。也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤;或粉紫色、中心較深的菌落，亦常為耐熱大腸菌群，應注意挑選。
5.3 挑取上述可疑菌落，涂片作革蘭氏染色鏡檢。
5.4 在蛋白胨水培養液中，加入靛基質(zhì)試劑約0.5mL，觀(guān)察靛基質(zhì)反應。陽(yáng)性反應液面呈玫瑰紅色;陰性反應液面呈試劑本色。
6.檢驗結果報告
經(jīng)上述檢驗步驟，若發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，平板上有典型菌落，并經(jīng)證實(shí)為革蘭氏陰性無(wú)芽胞短桿菌，靛基質(zhì)試驗陽(yáng)性，則可報告被檢樣品中檢出耐熱大腸菌群。
