菌落總數檢驗方法-化妝品安全技術(shù)規范(2022年版)

1.范圍

  本規范規定了化妝品中菌落總數的檢驗方法。

  本規范適用于化妝品菌落總數的測定。

2.定義

  2.1 菌落總數Aerobic bacterial count

  化妝品檢樣經(jīng)過(guò)處理，在一定條件下（如培養基、培養溫度、培養時(shí)間、pH值、需氧性質(zhì)等）培養后，1g(1mL)檢樣中形成的微生物菌落總數。所得結果包括本方法規定的條件下生長(cháng)的嗜中溫需氧菌和兼性厭氧菌的菌落總數。

  測定菌落總數便于判明樣品被細菌污染的程度,是對樣品進(jìn)行衛生學(xué)總評價(jià)的綜合依據。

3.儀器和設備

  3.1 三角瓶:250mL。

  3.2 量筒:200mL。

  3.3 pH計或精密pH 試紙。

  3.4 高壓滅菌器。

  3.5 試管:18mm×150mm。

  3.6 滅菌平皿:直徑90mm。

  3.7 滅菌刻度吸管:10mL、1mL。

  3.8 酒精燈。

  3.9 恒溫培養箱:36℃±1℃。

  3.10 放大鏡。

  3.11 恒溫水浴箱。

4.培養基和試劑

  4.1 生理鹽水:見(jiàn)總則中3.1。

  4.2 卵磷脂、吐溫80-營(yíng)養瓊脂培養基

  4.3 0.5%氯化三苯四氮唑（2,3,5-triphenyl terazolium chloride，TTC)

  制法:溶解后過(guò)濾除菌，或115℃高壓滅菌20min，裝于棕色試劑瓶，置4℃冰箱備用。

5操作步驟

  5.1 用滅菌吸管吸取1:10稀釋的檢液2mL，分別注入到兩個(gè)滅菌平皿內，每皿 1mL。另取1mL注入到9mL滅菌生理鹽水試管中(注意勿使吸管接觸液面)，并充分混勻，制成1:100檢液。更換一支吸管，吸取2mL，分別注入到兩個(gè)滅菌平皿內，每皿 1mL。如樣品含菌量高，還可再稀釋成1:1000，1:10000，......等，每個(gè)稀釋度應換1支吸管。

  5.2 將融化并冷至45℃~50℃的卵磷脂吐溫80營(yíng)養瓊脂培養基傾注到平皿內,每皿約15mL,隨即轉動(dòng)平皿，使檢液與培養基充分混合均勻，待瓊脂凝固后，翻轉平皿，置36℃±1℃培養箱內培養48h±2h。另取一個(gè)不加檢液的滅菌空平皿，加入約15mL卵磷脂吐溫80營(yíng)養瓊脂培養基，待瓊脂凝固后，翻轉平皿，置36℃1℃培養箱內培養48h±2h，為空白對照。5.3為便于區別化妝品中的顆粒與菌落,可在每100mL卵磷脂吐溫80營(yíng)養瓊脂中加入1mL0.5%的TTC溶液，如有細菌存在，培養后菌落呈紅色，而化妝品的顆粒顏色無(wú)變化。

6菌落計數方法

  先用肉眼觀(guān)察，點(diǎn)數菌落數，然后再用5倍~10倍的放大鏡檢查，以防遺漏。記下各平皿的菌落數后，求出同一稀釋度各平皿生長(cháng)的平均菌落數。若平皿中有連成片狀的菌落或花點(diǎn)樣菌落蔓延生長(cháng)時(shí)，該平皿不宜計數。若片狀菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落數分布又很均勻，則可將此半個(gè)平皿菌落計數后乘以2，以代表全皿菌落數。

7菌落計數及報告方法

  7.1 首先選取平均菌落數在30~300之間的平皿，作為菌落總數測定的范圍。當只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數符合此范圍時(shí),即以該平皿菌落數乘其稀釋倍數報告之(見(jiàn)表1中例1)。

  7.2 若有兩個(gè)稀釋度，其平均菌落數均在30~300之間，則應求出兩菌落總數之比值來(lái)決定，若其比值小于或等于2，應報告其平均數，若大于2則以其中稀釋度較低的平皿的菌落數報告之（見(jiàn)表1中例2及例3)）。

  7.3 若所有稀釋度的平均菌落數均大于300，則應按稀釋度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之（見(jiàn)表1中例4)）。

  7.4 若所有稀釋度的平均菌落數均小于30，則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之（見(jiàn)表1例5）。

  7.5 若所有稀釋度的平均菌落數均不在30~300之間，其中一個(gè)稀釋度大于300，而相鄰的另一稀釋度小于30時(shí)，則以接近30或300的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之(見(jiàn)表1中例6）。

  7.6 若所有的稀釋度均無(wú)菌生長(cháng)，報告數為每g或每mL小于10CFU。

  7.7 菌落計數的報告，菌落數在10以?xún)葧r(shí)，按實(shí)有數值報告之，大于100時(shí)，采用二位有效數字，在二位有效數字后面的數值，應以四舍五入法計算。為了縮短數字后面零的個(gè)數，可用10的指數來(lái)表示（見(jiàn)表1報告方式欄)。在報告菌落數為“不可計”時(shí)，應注明樣品的稀釋度。

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