羅氏培養基斜面管制備方法及注意事項

一、用途及原理

  羅氏培養基常用于培養分枝桿菌，特別是用于結核分枝桿菌的分離培養及卡介苗的傳代和保存。結核分枝桿菌為專(zhuān)性需氧菌，營(yíng)養要求較高，能耐酸，最適生長(cháng)pH為6.5-6.8，生長(cháng)緩慢，必須在含血清、卵黃、馬鈴薯、甘油及某些無(wú)機鹽類(lèi)的特殊培養基上才能生長(cháng)。羅氏培養基中的全蛋液營(yíng)養豐富，可促進(jìn)分枝桿菌快速生長(cháng)，培養基中的孔雀綠可抑制部分雜菌的生長(cháng)。

二、培養基配方

  注：由痰等標本中分離分枝桿菌時(shí)，若前處理方法為堿性物質(zhì)，可將培養基中的磷酸二氫鉀由2.4g增加至14g，即可制成酸性羅氏培養基；若前處理方法為酸性物質(zhì)，可將培養基中的2.4g磷酸二氫鉀改為3.6g磷酸氫二鉀，即可制成堿性羅氏培養基。

三、配制方法

  （1）基礎培養基：稱(chēng)取除全蛋液以外的成分加熱煮沸溶解于600mL純化水中，加熱過(guò)程需不停攪拌以防止馬鈴薯粉凝成塊或糊底，121℃滅菌15min，冷卻至55℃備用；

  （2）全蛋液制備：將新鮮雞蛋洗刷外殼后，浸于5%碳酸鈉溶液中約30min，用清水沖洗后，浸泡于75%乙醇溶液中數分鐘，在無(wú)菌環(huán)境中用滅菌的鑷子或其他器具打破蛋殼，將蛋液倒入含玻璃珠的無(wú)菌錐形瓶中（可預先將玻璃珠放入錐形瓶中，121℃高壓蒸汽滅菌15-30min），充分搖晃使蛋黃、蛋白搖散混合均勻。

  注：新鮮雞蛋內的蛋液通常是無(wú)菌的，無(wú)須進(jìn)行滅菌處理，操作過(guò)程應注意避免污染。若蛋液中可能殘存蛋殼碎渣，可將打散后的全蛋液用無(wú)菌紗布進(jìn)行過(guò)濾。

  （3）將1000mL全蛋液與600mL基礎溶液混合充分搖勻，無(wú)菌分裝于滅菌的試管中，每管5-7mL（視試管的大小調整裝量），擺長(cháng)斜面，用85-90℃流動(dòng)蒸汽滅菌1-1.5h至斜面完全凝固，取出冷卻后備用。制備好的羅氏培養基斜面應呈微綠色或黃綠色。

  注：不同于一般的培養基，此培養基中不使用瓊脂，而是通過(guò)蛋液的凝固效果制成固體培養基，因此硬度較低，且分枝桿菌生長(cháng)周期長(cháng)，為防止培養基過(guò)分失水變干，通常使用試管制成斜面使用而不是做成平板（平板通常培養3-5天后會(huì )有明顯失水變薄現象，而分枝桿菌通常需要培養數周的時(shí)間）。將蛋液與基礎培養基混合時(shí)，應緩慢倒入輕輕搖勻，防止產(chǎn)生過(guò)多氣泡。85-90℃的流動(dòng)蒸汽可以保持蛋液中的維生素不被破壞，也可使用凝固器加溫至85-90℃，若無(wú)流動(dòng)蒸汽滅菌器和凝固器，也可使用烘箱調節至85-90℃使培養基凝固。

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