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一、陰溝腸桿菌簡(jiǎn)介
陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）是腸桿菌科腸桿菌屬的模式菌，廣泛分布于自然界，普遍存在于人和動(dòng)物的腸道中，是醫院內感染和機會(huì )感染的常見(jiàn)細菌，也能引起食源性疾病，因此常常被當作條件致病菌的代表。
奶粉中陰溝腸桿菌的污染一直受到人們的關(guān)注，2004年4月，聯(lián)合國糧農組織和世界衛生組織的專(zhuān)家在評估嬰兒配方奶粉安全性時(shí)，認為陰溝腸桿菌在引起新生兒致病方面的重要性正在增長(cháng)，并且作為腸桿菌屬的代表（在嬰兒奶粉中以低濃度出現的）是潛在的嬰兒奶粉病原菌，在進(jìn)行嬰兒配方奶粉中致病菌的風(fēng)險分析時(shí)，將陰溝腸桿菌列為“B”類(lèi)危險性生物因子。
據調查報告表明奶粉中污染陰溝腸桿菌的含量一般較低，為此本方法定量檢測取樣量確定為333 g，以盡可能檢測出樣品中含量少的目標菌。
二、參考標準
《SN/T 2552.7-2010 乳與乳制品衛生微生物學(xué)檢驗方法 第7部分：陰溝腸桿菌檢驗》
三、陰溝腸桿菌檢驗方法
3.1 方法提要
奶粉中陰溝腸桿菌的分離與計數方法是應用微生物檢驗的增菌培養、分離、生化鑒定等方法對奶粉中可能存在的陰溝腸桿菌進(jìn)行定性和定量的檢驗。
3.2 檢驗程序
陰溝腸桿菌的檢驗程序見(jiàn)圖1。
圖1 陰溝腸桿菌檢驗程序
四、檢測步驟及結果判斷
4.1陰溝腸桿菌定量檢驗（MPN法）
4.1.1 定量檢驗是應用“三管”增菌法，檢驗和定量樣品中極少量的陰溝腸桿菌。檢驗需333g樣品。取樣見(jiàn)SN/T 2552.1。
4.1.2 取樣前消毒樣品包裝的開(kāi)啟處和取樣勺，無(wú)菌稱(chēng)取樣品100g、10g和1g各三份分別加入2L、250mL和125mL樣品稀釋瓶中，在各樣品稀釋瓶中分別加入900mL、90mL、9mL預熱到45℃的滅菌蒸餾水（1:10稀釋?zhuān)�，振搖使樣品充分混勻，36℃±1℃培養18h～22h。
4.1.3 分別移取培養18h～22h的懸液各10mL加入90mLEE肉湯中，36℃±1℃培養18h～22h。
腸道菌增菌肉湯（EE）檢驗原理：蛋白胨為微生物生長(cháng)提供蛋白質(zhì)、維生素和氨基酸；葡萄糖提供碳源；磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀為緩沖劑；牛膽鹽和煌綠為選擇性抑菌劑，可抑制非腸桿菌科細菌的生長(cháng)。
腸道菌增菌肉湯（EE）用法：稱(chēng)取本品45g，加熱攪拌溶解于1000mL蒸餾水中，分裝三角瓶，每瓶90mL，100℃加熱30分鐘，迅速在流動(dòng)的冷水中冷卻，無(wú)需高壓滅菌。培養結果如圖2所示：
圖2 陰溝腸桿菌在EE肉湯中的培養結果
4.1.4 輕輕混勻增菌液，用下列方法進(jìn)行平板接種：
直接涂布法：每份增菌液取0.2mL加到2個(gè)陰溝腸桿菌分離瓊脂平板（ECIA），每個(gè)平板0.1mL，用無(wú)菌玻璃涂布棒涂布（如果預計奶粉中含有大量的細菌，應使用滅菌的EE肉湯將增菌液稀釋10-4~10-6后涂布）。
直接劃線(xiàn)法：每份增菌液用3mm接種環(huán)（10μL）分別接種2個(gè)陰溝腸桿菌分離瓊脂平板，三區法或四區法劃線(xiàn)，以得到單個(gè)菌落。將平板倒置于36℃±1℃，培養18h～22h。
陰溝腸桿菌分離瓊脂（ECIA）檢驗原理：特殊蛋白胨為微生物的生長(cháng)提供氮源、維生素和生長(cháng)因子；氯化鈉維持均衡的滲透壓；3號膽鹽和結晶紫為抑菌劑；溴麝香草酚藍為pH指示劑，變色范圍為pH值6.0~7.6，酸性呈黃色，堿性呈藍色；棉子糖為可發(fā)酵糖類(lèi)，發(fā)酵糖產(chǎn)酸的菌落呈黃色；瓊脂是培養基的凝固劑。
陰溝腸桿菌分離瓊脂（ECIA）用法：稱(chēng)取本品49.6g，加熱煮沸溶解于1000mL蒸餾水中，冷卻至50℃左右時(shí)，傾入無(wú)菌平皿，備用。無(wú)需高壓滅菌。培養結果如圖3所示：
圖3 陰溝腸桿菌在ECIA平板上的培養結果
4.1.5 觀(guān)察平板上陰溝腸桿菌的典型形態(tài)
在陰溝腸桿菌分離瓊脂平板上：黃色菌落，圓形，凸起，直徑2mm~3mm。
4.1.6 從陰溝腸桿菌分離瓊脂平板上挑取5個(gè)可疑菌落，分別進(jìn)行初步生化試驗：賴(lài)氨酸脫羧酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶試驗。初步生化試驗結果如圖4：
圖4 初步生化實(shí)驗結果
4.1.7 對賴(lài)氨酸脫羧酶陰性、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶陽(yáng)性、精氨酸雙水解酶陽(yáng)性的可疑菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，氧化酶試驗。革蘭氏染色陰性，氧化酶試驗陰性按表1進(jìn)行生化試驗。革蘭氏染色結果如圖5，氧化酶試驗結果如圖5：
圖5 陰溝腸桿菌革蘭氏染色結果，陰溝腸桿菌氧化酶實(shí)驗結果
4.1.8 腸桿菌屬細菌生化特征見(jiàn)表1。生化試驗結果如圖6所示。
表1 腸桿菌屬細菌生化特征
|
試驗 |
生化特征 |
|||||
|
陰溝腸桿菌 E.cloacae |
阪崎腸桿菌 E.sakazakii |
產(chǎn)氣腸桿菌 E.aerogenes |
聚團腸桿菌 E.agglomerans |
格高菲腸桿菌 E.gergoviae |
||
|
賴(lài)氨酸脫酸酶 |
－ |
－ |
＋ |
－ |
＋ |
|
|
精氨酸雙水解酶 |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
－ |
|
|
鳥(niǎo)氨酸脫酸酶 |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
|
|
發(fā)酵 |
KCN生長(cháng) |
＋ |
＋ |
＋ |
v |
－ |
|
蔗糖 |
＋ |
＋ |
＋ |
（＋） |
＋ |
|
|
衛矛醇 |
（－） |
－ |
－ |
（－） |
－ |
|
|
核糖醇 |
（－） |
－ |
＋ |
－ |
－ |
|
|
棉子糖 |
＋ |
＋ |
＋ |
v |
＋ |
|
|
D-山梨醇 |
＋ |
－ |
＋ |
v |
－ |
|
|
α-甲基-D-葡萄糖苷 |
（＋） |
＋ |
－ |
－ |
－ |
|
|
D-阿拉伯糖 |
（－） |
－ |
＋ |
－ |
＋ |
|
|
黃色素 |
－ |
＋ |
－ |
（＋） |
－ |
|
|
注：＋：90%~100%陽(yáng)性；（＋）：75%~89%陽(yáng)性；v：25%~74%陽(yáng)性；（－）：10%~24%陽(yáng)性；－：0%~9%陽(yáng)性 |
||||||
圖6 確證生化試驗結果
4.1.9 計算MPN值，根據每一稀釋度檢出的陰溝腸桿菌的結果查MPN表（見(jiàn)表2），計算并報告每100g樣品中的陰溝腸桿菌的最近似值。
4.2陰溝腸桿菌定性檢驗
4.2.1 檢驗樣品中是否有陰溝腸桿菌，檢驗需100g樣品。
4.2.2 取樣前消毒樣品包裝的開(kāi)啟處和取樣勺，無(wú)菌稱(chēng)取樣品100g至2L的樣品稀釋瓶中，加入900mL預熱到45℃的滅菌蒸餾水，或將樣品直接稱(chēng)量到裝有9倍預熱到45℃的滅菌蒸餾水的樣品稀釋瓶中，振搖使樣品充分混勻，36℃±1℃培養18h～22h。
4.2.3 移取培養18h~22h的懸液各10mL加入90mL EE肉湯中，36℃±1℃培養18h～22h。
4.2.4 操作同4.1.4~4.1.8。
4.2.5 根據檢驗結果，報告每100 g樣品中是否檢出陰溝腸桿菌。
表2 最可能數（MPN）表（95%置信區間）
使用三管法，接種量分別為10.0g，1.0g和0.1g。
|
陽(yáng)性管數 |
MPN /100g |
可信限 |
陽(yáng)性管數 |
MPN /100g |
可信限 |
||||||
|
10 |
1 |
0.1 |
低 |
高 |
10 |
1 |
0.1 |
低 |
高 |
||
|
0 |
0 |
0 |
＜3.0 |
- |
9.5 |
2 |
2 |
0 |
21 |
4.5 |
42 |
|
0 |
0 |
1 |
3.0 |
0.15 |
9.6 |
2 |
2 |
1 |
28 |
8.7 |
94 |
|
0 |
1 |
0 |
3.0 |
0.15 |
11 |
2 |
2 |
2 |
35 |
8.7 |
94 |
|
0 |
1 |
1 |
6.1 |
1.2 |
18 |
2 |
3 |
0 |
29 |
8.7 |
94 |
|
0 |
2 |
0 |
6.2 |
1.2 |
18 |
2 |
3 |
1 |
36 |
8.7 |
94 |
|
0 |
3 |
0 |
9.4 |
3.6 |
38 |
3 |
0 |
0 |
23 |
4.6 |
94 |
|
1 |
0 |
0 |
3.6 |
0.17 |
18 |
3 |
0 |
1 |
38 |
8.7 |
110 |
|
1 |
0 |
1 |
7.2 |
1.3 |
18 |
3 |
0 |
2 |
64 |
17 |
180 |
|
1 |
0 |
2 |
11 |
3.6 |
38 |
3 |
1 |
0 |
43 |
9 |
180 |
|
1 |
1 |
0 |
7.4 |
1.3 |
20 |
3 |
1 |
1 |
75 |
17 |
200 |
|
1 |
1 |
1 |
11 |
3.6 |
38 |
3 |
1 |
2 |
120 |
37 |
420 |
|
1 |
2 |
0 |
11 |
3.6 |
42 |
3 |
1 |
3 |
160 |
40 |
420 |
|
1 |
2 |
1 |
15 |
4.5 |
42 |
3 |
2 |
0 |
93 |
18 |
420 |
|
1 |
3 |
0 |
16 |
4.5 |
42 |
3 |
2 |
1 |
150 |
37 |
420 |
|
2 |
0 |
0 |
9.2 |
4.4 |
38 |
3 |
2 |
2 |
210 |
40 |
430 |
|
2 |
0 |
1 |
14 |
3.6 |
42 |
3 |
2 |
3 |
290 |
90 |
1000 |
|
2 |
0 |
2 |
20 |
4.5 |
42 |
3 |
3 |
0 |
240 |
42 |
1000 |
|
2 |
1 |
0 |
15 |
3.7 |
42 |
3 |
3 |
1 |
460 |
90 |
2000 |
|
2 |
1 |
1 |
20 |
4.5 |
42 |
3 |
3 |
2 |
1100 |
180 |
4100 |
|
2 |
1 |
2 |
27 |
8.7 |
91 |
3 |
3 |
3 |
＞1100 |
420 |
- |
|
注：如果接種量擴大10倍，分別為100.0 g，10.0 g和1 g時(shí)，表中的數字相應縮小10倍。如果接種量縮小10倍，分別為1.0 g，0.1 g和0.01 g時(shí)，表中的數字相應擴大10倍，其余類(lèi)推。 |
|||||||||||
相關(guān)標準：
SN/T 2552.7-2010 乳與乳制品衛生微生物學(xué)檢驗方法 第7部分 陰溝腸桿菌檢驗 -標準下載
相關(guān)產(chǎn)品：
腸道菌增菌肉湯（EE）-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情
陰溝腸桿菌分離瓊脂（ECIA）-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情
注:本文屬海博生物原創(chuàng ),未經(jīng)允許不得轉載。
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