海博微信公眾號
海博天貓旗艦店
海博微信公眾號
海博天貓旗艦店
一、檸檬酸桿菌簡(jiǎn)介
檸檬酸桿菌（Citrobacter），革蘭氏陰性兼性厭氧菌。直桿菌、直徑約1.0μm，長(cháng)2.0μm~6.0μm。有呼吸和發(fā)酵兩種代謝類(lèi)型。氧化酶陰性，動(dòng)力試驗、ONPG試驗陽(yáng)性，能利用檸檬酸鹽，能夠液化明膠，DNA酶試驗和V-P試驗陰性。根據《伯杰氏細菌學(xué)分類(lèi)手冊》，檸檬酸桿菌屬分為弗氏檸檬酸桿菌（C.freundii）、科氏檸檬酸桿菌（C.diversus）和無(wú)丙二酸鹽檸檬酸桿菌（C.amalonaticus）三個(gè)種。
二、參考標準；
《SN/T 2552.6-2010 乳與乳制品衛生微生物學(xué)檢驗方法 第6部分：檸檬酸桿菌檢驗》
三、檢測步驟及結果判斷
3.1 增菌
無(wú)菌稱(chēng)取樣品100g，10g和1g各三份分別加入2000mL、250mL和100mL樣品稀釋瓶中，加入9倍預熱到45℃的滅菌蒸餾水（1:10稀釋?zhuān)�，或者將樣品直接稱(chēng)量到裝有9倍預熱到45℃的滅菌蒸餾水的樣品稀釋瓶中，振搖使樣品充分混勻，36℃±1℃培養18h～24h。
分別移取培養18h~24h的懸液各10mL加入90mL四硫磺酸鹽煌綠增菌肉湯（TTB）中，36℃±1℃培養18h～24h。
四硫磺酸鹽煌綠增菌肉湯（TTB）檢驗原理：
蛋白胨和牛肉粉提供碳源、氮源和維生素，滿(mǎn)足細菌生長(cháng)的需求；氯化鈉可維持均衡的滲透壓；碳酸鈣能中和細菌產(chǎn)酸及吸收有毒的代謝產(chǎn)物；硫代硫酸鈉和四硫磺酸鈉結合可抑制腸道共生菌（四硫磺酸鈉是在培養基加入碘和碘化鉀時(shí)形成），而具有四硫磺酸鈉還原酶的細菌能在此培養基中繁殖；膽鹽和煌綠可抑制大腸群菌和其它革蘭氏陽(yáng)性細菌。
四硫磺酸鹽煌綠增菌肉湯（TTB）用法：
稱(chēng)取本品93.55g，溶解于1050mL蒸餾水中，加熱煮沸，121℃高壓滅菌15分鐘，臨用前加入20%碘液 20mL，0.1% 煌綠10mL，現配現用，不宜久置。培養結果如圖1所示：
圖1 弗氏檸檬酸桿菌在TTB中的培養結果
3.2 分離培養
輕輕混勻增菌液，每份增菌液用接種環(huán)接種沙門(mén)氏菌志賀氏菌分離瓊脂（SS）平板、亞硫酸鉍瓊脂（BS）平板。采用三區法或四區法劃線(xiàn)，以獲得單個(gè)菌落。將平板倒置于36℃±1℃，SS瓊脂平板培養18h～24h，BS瓊脂平板培養40h～48h。
從SS平板和BS平板上分別挑取3個(gè)~5個(gè)可疑菌落，在營(yíng)養瓊脂斜面上純化培養。檸檬酸桿菌在SS瓊脂平板上的可疑菌落為圓形，粉紅色、黑色、無(wú)色菌落，或粉紅色、黑色中心菌落；在BS瓊脂平板上的可疑菌落為棕綠色或棕黑色菌落。
SS瓊脂培養基檢驗原理：
䏡胨、牛肉浸粉提供碳源、氮源、維生素和礦物質(zhì)；乳糖為可發(fā)酵的糖類(lèi)；三號膽鹽、枸櫞酸鈉和煌綠抑制革蘭氏陽(yáng)性菌及大多數的大腸菌群和變形桿菌；硫代硫酸鈉和枸櫞酸鐵用于檢測硫化氫的產(chǎn)生，使菌落中心呈黑色；中性紅為pH指示劑，發(fā)酵糖產(chǎn)酸的菌落呈紅色，不發(fā)酵糖的菌落為無(wú)色；瓊脂是培養基的凝固劑。
SS瓊脂培養基用法：
稱(chēng)取本品63.53g，溶解于1000mL蒸餾水中，加熱煮至沸，不必高壓蒸汽滅菌，冷至45℃-50℃倒成平板。培養結果如圖2所示：
圖2 弗氏檸檬酸桿菌ATCC 43864在SS瓊脂平板上的培養結果
亞硫酸鉍瓊脂（BS）檢驗原理：
蛋白胨、牛肉粉在培養基中作為基礎營(yíng)養物質(zhì)，為細菌生長(cháng)提供所需的氮源、碳源、維生素及一些礦物質(zhì)等元素；葡萄糖可作為細菌生長(cháng)代謝所需的能量物質(zhì)；磷酸鹽對培養環(huán)境pH值起到緩沖作用�；途G和亞硫酸鈉能抑制大腸桿菌、變形桿菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(cháng)。傷寒沙門(mén)氏菌及其他沙門(mén)氏菌能利用葡萄糖，將亞硫酸鹽還原成硫化物并與硫酸亞鐵反應使得菌落呈黑色，此外還可把鉍離子還原成金屬鉍，使菌落呈現金屬光澤，從而使沙門(mén)氏菌得到分離。
亞硫酸鉍瓊脂（BS）用法：
稱(chēng)取本品50.3g，加入1000 mL蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，冷至45℃-50℃，搖勻，傾入無(wú)菌平皿備用。無(wú)需高壓滅菌。保存于黑暗處，48小時(shí)內使用。培養結果如圖3所示：
圖3 弗氏檸檬酸桿菌ATCC 43864在BS瓊脂平板上的培養結果
3.3 分離鑒定
3.3.1 方法選擇
對挑選的菌體進(jìn)行革蘭氏染色，氧化酶試驗初步生化鑒定。革蘭氏染色陰性，氧化酶試驗陰性按3.3.2進(jìn)行初步生化試驗。革蘭氏染色結果如圖4A，氧化酶試驗結果如圖4B：
圖4 弗氏檸檬酸桿菌ATCC 43864革蘭氏染色結果，弗氏檸檬酸桿菌ATCC 43864氧化酶實(shí)驗結果
3.3.2 初步生化鑒定
使用營(yíng)養瓊脂平板或斜面上純化分離的新鮮培養物（培養時(shí)間不超過(guò)24h）進(jìn)行動(dòng)力試驗、ONPG試驗、檸檬酸鹽試驗、DNA酶試驗（或明膠液化試驗）和V-P試驗。動(dòng)力試驗、ONPG試驗和檸檬酸鹽試驗陽(yáng)性，DNA酶試驗（或明膠液化試驗）和V-P試驗陰性的菌落為檸檬酸桿菌屬細菌。再次用營(yíng)養瓊脂純化培養18h～24h后，進(jìn)行后續生化試驗。初步生化鑒定結果如圖5所示：
圖5 弗氏檸檬酸桿菌ATCC 43864初步生化鑒定結果
3.3.3 生化鑒定
使用營(yíng)養瓊脂上的新鮮培養物（培養時(shí)間不超過(guò)24 h）按表1各項生化試驗進(jìn)行檸檬酸桿菌各種的鑒定。確證鑒定結果如圖6所示：
表1 檸檬酸桿菌屬生化鑒定表
|
確證實(shí)驗 |
弗氏檸檬 酸桿菌 （C.freundii） |
科氏檸檬 酸桿菌 （C.diversus） |
無(wú)丙二酸鹽 檸檬酸桿菌 （C.amalonaticus） |
|
水楊酸發(fā)酵產(chǎn)酸 |
﹣ |
V(﹣) |
V |
|
D-戊糖醇發(fā)酵產(chǎn)酸 |
﹣ |
＋ |
﹣ |
|
產(chǎn)硫化氫 |
V(＋) |
﹣ |
﹣ |
|
鳥(niǎo)氨酸脫酸酶 |
V(﹣) |
＋ |
＋ |
|
靛基質(zhì) |
﹣ |
＋ |
＋ |
|
丙二酸鹽利用 |
V(﹣) |
＋ |
﹣ |
|
注：＋：≥90%陽(yáng)性；(＋)：75%~89%陽(yáng)性；d：不同菌株不定；(﹣)：75%~89%陰性；﹣：≥90%陰性。 |
|||
圖6 弗氏檸檬酸桿菌確證生化鑒定結果
四、結果判定與結果報告
4.1 結果判定
4.1.1 檸檬酸桿菌屬
革蘭氏染色陰性，氧化酶實(shí)驗陰性，生化反應符合3.3.2要求的菌落，判定為檸檬酸桿菌屬細菌。
4.1.2 檸檬酸桿菌
革蘭氏染色陰性，氧化酶實(shí)驗陰性，生化反應結果與3.3.2和3.3.3中表1的生化反應結果相符，或根據生化鑒定試劑盒、生化鑒定系統鑒定到檸檬酸桿菌屬的結果，可判定為特定的檸檬酸桿菌。
4.2 結果報告
生化鑒定結果符合檸檬酸桿菌生化特性，按增菌培養的陽(yáng)性瓶數，應用MPN表，查出每100 g樣品中的MPN值。檢測結果報告為每100 g樣品中檸檬酸桿菌（屬或種）的MPN值。
表2 最可能數（MPN）表（95%置信區間）
使用三管法，接種量分別為10.0 g，1.0 g和0.1 g。
|
陽(yáng)性管數 |
MPN /100g |
可信限 |
陽(yáng)性管數 |
MPN /100g |
可信限 |
||||||
|
10 |
1 |
0.1 |
低 |
高 |
10 |
1 |
0.1 |
低 |
高 |
||
|
0 |
0 |
0 |
＜3.0 |
- |
9.5 |
2 |
2 |
0 |
21 |
4.5 |
42 |
|
0 |
0 |
1 |
3.0 |
0.15 |
9.6 |
2 |
2 |
1 |
28 |
8.7 |
94 |
|
0 |
1 |
0 |
3.0 |
0.15 |
11 |
2 |
2 |
2 |
35 |
8.7 |
94 |
|
0 |
1 |
1 |
6.1 |
1.2 |
18 |
2 |
3 |
0 |
29 |
8.7 |
94 |
|
0 |
2 |
0 |
6.2 |
1.2 |
18 |
2 |
3 |
1 |
36 |
8.7 |
94 |
|
0 |
3 |
0 |
9.4 |
3.6 |
38 |
3 |
0 |
0 |
23 |
4.6 |
94 |
|
1 |
0 |
0 |
3.6 |
0.17 |
18 |
3 |
0 |
1 |
38 |
8.7 |
110 |
|
1 |
0 |
1 |
7.2 |
1.3 |
18 |
3 |
0 |
2 |
64 |
17 |
180 |
|
1 |
0 |
2 |
11 |
3.6 |
38 |
3 |
1 |
0 |
43 |
9 |
180 |
|
1 |
1 |
0 |
7.4 |
1.3 |
20 |
3 |
1 |
1 |
75 |
17 |
200 |
|
1 |
1 |
1 |
11 |
3.6 |
38 |
3 |
1 |
2 |
120 |
37 |
420 |
|
1 |
2 |
0 |
11 |
3.6 |
42 |
3 |
1 |
3 |
160 |
40 |
420 |
|
1 |
2 |
1 |
15 |
4.5 |
42 |
3 |
2 |
0 |
93 |
18 |
420 |
|
1 |
3 |
0 |
16 |
4.5 |
42 |
3 |
2 |
1 |
150 |
37 |
420 |
|
2 |
0 |
0 |
9.2 |
4.4 |
38 |
3 |
2 |
2 |
210 |
40 |
430 |
|
2 |
0 |
1 |
14 |
3.6 |
42 |
3 |
2 |
3 |
290 |
90 |
1000 |
|
2 |
0 |
2 |
20 |
4.5 |
42 |
3 |
3 |
0 |
240 |
42 |
1000 |
|
2 |
1 |
0 |
15 |
3.7 |
42 |
3 |
3 |
1 |
460 |
90 |
2000 |
|
2 |
1 |
1 |
20 |
4.5 |
42 |
3 |
3 |
2 |
1100 |
180 |
4100 |
|
2 |
1 |
2 |
27 |
8.7 |
91 |
3 |
3 |
3 |
＞1100 |
420 |
- |
|
注：如果接種量擴大10倍，分別為100.0g，10.0g和1g時(shí)，表中的數字相應縮小10倍。如果接種量縮小10倍，分別為1.0g，0.1g和0.01g時(shí)，表中的數字相應擴大10倍，其余類(lèi)推。 |
|||||||||||
相關(guān)標準：
SN/T 2552.6-2010 乳與乳制品衛生微生物學(xué)檢驗方法 第6部分：檸檬酸桿菌檢驗 點(diǎn)擊下載
相關(guān)產(chǎn)品：
四硫磺酸鹽煌綠增菌液基礎(TTB)-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情
亞硫酸鉍瓊脂（BS）-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情
注:本文屬海博生物原創(chuàng ),未經(jīng)允許不得轉載。
上一篇：蠟樣芽孢桿菌檢驗方法及結果判斷
下一篇：陰溝腸桿菌的檢驗方法及結果判斷
