微生物的誘變和突變回復試驗

一、實(shí)驗原理

  紫外線(xiàn)是一種最常用的物理誘變因素，它的主要作用是使DNA雙鏈中的兩個(gè)相鄰的嘧啶核苷酸形成二聚體，并阻礙雙鏈的解開(kāi)和復制，從而引起基因突變，最終導致表形的變化，如產(chǎn)生色素能力的消失，喪失合成某種氨基酸的能力，以及抗藥性的變化等。紫外線(xiàn)照射后造成的DNA損傷，一般在可見(jiàn)光照射下，由于光激活酶的作用，可將嘧啶二聚體解開(kāi)，使其恢復正常，這稱(chēng)為光復活作用。為避免光復活，當用紫外線(xiàn)進(jìn)行誘變處理時(shí)及處理后的操作都應在紅光下進(jìn)行，并且應將微生物在黑暗的條件下進(jìn)行培養。

  亞硝基胍（NTG）是一種揮發(fā)性的烷化劑，具有很強的誘變作用，它的作用機制主要是引起NTGDNA鏈中G：

  C——A：T的轉換，它的殺菌作用雖很低，但在存活菌中突變率很高。故成為超級誘變劑。

  艾姆氏試驗的基本原理是利用鼠傷寒沙門(mén)氏菌的組氨酸營(yíng)養缺陷型（his-）菌株發(fā)生回復突變性能來(lái)檢測物質(zhì)的誘變及致癌性能，此菌株在不含組氨酸的基本培養基上不能生長(cháng)，但遇有誘變性能的物質(zhì)后可發(fā)生回復突變，因而在基本培養基上也能生長(cháng)，形成肉眼可見(jiàn)的菌落，因此可以在短時(shí)間內，根據回復突變發(fā)生的頻率來(lái)判定該物質(zhì)是否具有誘變或致癌的性能。由于有些被檢測的致癌劑需要哺乳動(dòng)物肝細胞中的羥化酶系統激活后方能顯示致突變物的活性，所以在進(jìn)行試驗時(shí)還需要加入哺乳動(dòng)物肝細胞內微粒體的酶作為體外活化系統（S-9混合液），提高陽(yáng)性物的測出率。所以艾姆氏試驗也稱(chēng)鼠傷寒沙門(mén)氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體試驗。

二、實(shí)驗步驟

  （一）紫外線(xiàn)的誘變作用

  1.菌懸液的準備

  （1）將1299菌株轉接完全培養基斜面，32℃培養24小時(shí)。

  （2）自斜面取一接種環(huán)菌接與20ml/250 ml三角瓶的肉湯培養基中，32℃培養18小時(shí)。

  （3）取培養液離心3000 rpm離心15分鐘，棄去上清液，用生理鹽水洗菌體兩次，再加適量的生理鹽水。顯微鏡直接計數法，使菌體濃度為10⁸個(gè)/ml。

  2.誘變處理

  （1）吸取上述無(wú)菌液10mL于無(wú)菌平皿中（皿內放一攪拌子，下為磁力攪拌器），放在15W紫外燈下,距離28.5cm照射60秒，取出放在紅燈下，將上述經(jīng)誘變處理的菌懸液以10倍稀釋法，具體可按估計的存活率進(jìn)行稀釋。

  （2）取各稀釋率下的菌液0.1 ml接于肉湯培養基中，用黑紙包好，32℃培養48小時(shí)。

  3.淘汰野生型

  （1）取肉湯培養基3000 rpm離心15分鐘，以生理鹽水洗滌兩次，加到5mL無(wú)氮培養基饑餓培養4~6小時(shí)。

  （2）加入與無(wú)氮培養基等量的二倍氮培養基，培養3~4小時(shí)再加青霉素，使青霉素的最終濃度為200單位/毫升。放置3小時(shí)

  （3）取上述菌液0.1毫升涂于完全培養基平板上，32℃培養8小時(shí)。

  4.營(yíng)養缺陷型菌株的檢出

  （1）準備完全培養基和基本培養基平板各三個(gè)。將劃有若干小格并編號的圓形紙貼到平板的背面。

  （2）用無(wú)菌牙簽選取菌落，分別接種于基本培養基和完全培養基的相應位置，32℃培養24小時(shí)。

  （3）在完全培養基上生長(cháng)而在基本培養基上不生長(cháng)的菌落，轉接在完全培養基斜面上，32℃培養24~48小時(shí)。

  5.營(yíng)養缺陷型類(lèi)型的鑒定

  （1）營(yíng)養缺陷型分為氨基酸、核酸堿基、維生素三大類(lèi)物質(zhì)。

  （2）將待測菌株制成細胞懸液，濃度為10⁸個(gè)/ml。

  （3）制作基本培養基混菌平板。

  （4）待冷凝后分為三個(gè)區，標明氨基酸，堿基，維生素，用接種針將相應物質(zhì)放在各區中間。

  （5）37℃培養24小時(shí)，觀(guān)察生長(cháng)情況，哪個(gè)區生長(cháng)，就說(shuō)明缺陷型菌株需要哪類(lèi)物質(zhì)。

  6.營(yíng)養缺陷型具體營(yíng)養要求的鑒定

  （1）將待測菌株制成細胞懸液，濃度為10⁸個(gè)/ ml。

  （2）制作基本培養基混菌平板。

  （3）對于具體氨基酸缺陷型的鑒定，可先將各種氨基酸分為6組，如表1，將待測平皿分為六區，分別將6組氨基酸點(diǎn)在六區中央位置，30℃培養24小時(shí)，觀(guān)察生長(cháng)譜（表2）即可確定具體所需要的營(yíng)養物質(zhì)。

  （4）核酸堿基缺陷型的鑒定（只做4種物質(zhì)），將待測平皿分為四區，在中央位置分別點(diǎn)上，黃嘌呤、腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤，次黃嘌呤，37℃培養24小時(shí)，觀(guān)察生長(cháng)情況，即可確定具體所需營(yíng)養物質(zhì)。

  7.復測

  經(jīng)上述步驟確定的各菌株的營(yíng)養要求，再以所確定的純一的營(yíng)養物質(zhì)所配制的補充培養基復測一次，如果在補充培養基上生長(cháng)，在對照的基本培養上不生長(cháng)，則該菌無(wú)疑是這種物質(zhì)的缺陷型。

（二）NTG對谷氨酸棒桿菌1299的誘變效應

  1.制備含菌平板

  （1）將活化的斜面菌種挑一環(huán)接種于5ml的肉湯培養基中，37℃培養過(guò)夜。

  （2）次日，按5％接種量取上述菌液于肉湯培養基中，37℃培養6－7h。

  （3）取0.2mL菌液于完全培養基平板上，用無(wú)菌涂棒將菌液均勻的涂滿(mǎn)整個(gè)平板表面，倒置培養2h。

  2.誘變處理

  在上述含菌平板的中央和其他部位放少許NTG結晶，然后將培養皿倒置于37℃恒溫箱中，培養24h。

  3.增殖培養

  放有NTG藥物的周?chē)�有一透明的抑菌圈，緊靠抑菌圈有一個(gè)生長(cháng)較密集的生長(cháng)圈，用接種環(huán)挑取該處菌苔于裝有20mL肉湯培養生物科學(xué)與工程系微生物學(xué)教學(xué)研究室基的三角瓶中，于37℃恒溫箱中，培養過(guò)夜，使誘變后的突變體進(jìn)行繁殖，以增加菌數。

  4.淘汰野生型

  （1）培養菌液：取增殖后的菌液5mL于無(wú)菌離心管中，3500r/min離心10min，倒去上清夜，再用生理鹽水洗滌兩次，離心，去上清液后的約1/10菌液接種到5mL無(wú)氮基本培養基中培養12h。

  （2）加青霉素：取上述菌液5mL加到5mL高滲培養液的三角瓶中，再加入青霉素，使最終濃度約為500單位/mL，再置于37℃恒溫箱中繼續培養6h，離心，棄去上清夜，重新懸浮于5mL無(wú)氮基本培養基中置冰箱保存。

  （3）涂布平板：取上述培養液的原液和10－1、10－2的稀釋液各0.1mL，分別涂布于完全培養基平板上，置于37℃恒溫箱中繼續培養24h，然后選取合適的平板（約長(cháng)有50－200個(gè)菌落）用作營(yíng)養缺陷型的檢查（如無(wú)合適平板，可取保存于冰箱中經(jīng)青霉素處理過(guò)的菌液再行稀釋、涂布）。

  5.缺陷型的檢出

  同紫外線(xiàn)誘變處理的缺陷型的檢出。

  (三)艾姆氏試驗檢測突變回復

  1.組氨酸營(yíng)養缺陷型(his+)鑒定

  基于菌株只能在含組氨酸的培養基上生長(cháng)、無(wú)組氨酸的培養基上不能生長(cháng)的原因,將下層培養基融化,冷卻至50℃左右,倒入4個(gè)培養皿內,冷凝后倒置過(guò)夜制成底層平板。從測試菌株TA100及對照菌株斜面各取一環(huán)分別接入肉膏蛋白胨培養液內，37℃，培養16~24h后離心，取菌體并用生理鹽水洗滌3次，然后制成菌懸液（濃度1~2×109/mL）。取氯化鈉瓊脂融化并冷卻至45℃左右，保溫，各管加0.1mL菌液,每個(gè)菌株做兩管,迅速搖勻并倒在底層平板上鋪勻.在各培養皿背面用記號比標出1,2,3三點(diǎn).翻轉平皿,打開(kāi)皿蓋,在“1”處加微量的組氨酸顆粒,“2”處滴加組氨酸-生物素混合液1小滴,“3”處不加作為對照。37℃，培養2天，觀(guān)察結果，要求結果為檢測菌株為組氨酸-生物素缺陷型。

  2.亞硝基胍致突變效應的檢測

  （1）自發(fā)回復突變對照

  將下層培養基融化后倒入平皿，制成底層平板。上層培養基融化后冷至45℃左右，加0.1mL菌懸液、0.5mLS-9混合液,不加待測樣品液。經(jīng)37℃培養48h后，觀(guān)察在下層平板上長(cháng)出的菌落表示為該菌自發(fā)回復突變后生成。記錄并算出每組平皿菌落平均數/皿，以Rc表示。

  突變率（MR）=每皿誘變菌落均數（Rt）/每皿自發(fā)回復突變菌落均數（Rc）

  只有突變率〉2才認為樣品屬艾姆氏試驗陽(yáng)性。當試驗樣品濃度達到500μg/皿仍未能出現陽(yáng)性結果時(shí)，便可報告該待測樣品屬艾姆氏試驗陰性。

  對于陽(yáng)性結果的樣品，其試驗結果尚要經(jīng)統計分析，若計算劑量與回變菌落之間有可重復的相關(guān)系數，經(jīng)相關(guān)顯著(zhù)性檢驗，最后才能確認為陽(yáng)性。

  （2）陰性對照

  為說(shuō)明樣品本身確為艾姆氏試驗陽(yáng)性而與配制樣品液所用的溶劑無(wú)關(guān)，所以陰性對照是采用配制樣品時(shí)的溶劑。

  3.亞硝基胍致突變效應的檢測

  取測試菌珠1管接肉膏培養基活化，37℃，培養16~24h后離心，將菌體用生理鹽水洗滌3次，最后配成濃度為1~2×10⁹/mL菌懸液備用.融化下層培養基并倒入6套平皿制成平板,用記號筆作好標記.做1μg、5μg、10μg三種濃度,每濃度每菌重復兩皿。取上層培養基6管融化并冷卻至45℃左右，標記各管1~6號。每管加TA100菌懸液0.1mL、0.5mLS-9混合液到1~6管.迅速搖勻后,倒在底層平板上,待凝固后在每皿中央放置1片直徑為6mm無(wú)菌濾紙片。在1、2各皿的濾紙上滴加濃度為50μg /mL的NTG0.02mL,在3、4各皿濾紙滴加250μg NTG0.02mL,在5、6各皿濾紙滴加500μg NTG0.02mL,即終濃度為1μg、5μg、10μg。37℃，培養48h觀(guān)察結果。

  本文章來(lái)自大連理工大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)院袁文杰老師，如有侵權，請及時(shí)告知，聯(lián)系刪除！

上一篇：生化反應中的D型與L型的糖、醇、氨基酸說(shuō)明

下一篇：TTC添加的注意事項