免疫膠乳

【原理】

  將抗原或抗體致敏在膠乳微粒上,此膠乳即具有免疫學(xué)性質(zhì),稱(chēng)為免疫膠乳,當致敏的抗原膠乳與相應抗體相遇時(shí),在有電解質(zhì)的條件下,抗原很快和抗體結合,從而膠乳微粒被動(dòng)地凝集起來(lái),稱(chēng)為膠乳凝集試驗。

  將待測抗原樣品中先加入一定量的抗體,反應一段時(shí)間,再加入抗原膠乳,先加入的兩種成分因是對應的而結合起來(lái),抑制了抗原膠乳與抗體的凝集反應,稱(chēng)為膠乳凝集抑制試驗。

  用抗體致敏膠乳直接測定抗原的方法,稱(chēng)為反向膠乳凝集試驗。

【成分】

【制法】

  1.聚苯乙烯免疫膠乳的制備:上海第六人民醫院檢驗科曾對聚苯乙烯膠乳的制備、篩選以及致敏等問(wèn)題作過(guò)詳細的介紹.現有商品出售可不必自行制備。以下例舉兩種方法制備免疫聚苯乙烯膠乳的方法。

  (1)胰酶處理聚苯乙烯膠乳致敏炭疽抗血清:

  ①聚苯乙烯膠乳的處理:取10%聚苯乙烯膠乳1ml,加蒸水4ml稀釋成2%,再加pH8.2硼酸緩沖鹽水(BBS)12ml 和1%胰酶溶液2ml,充分混合,置45℃水浴中約18小時(shí),7500rpm離心30分鐘,去上清,加pH8.2 BBS10ml,制成1%膠乳備用。

  ②將炭疽桿菌抗血清于56℃水浴中加溫30分鐘,用pH7.2磷酸鹽緩沖液稀釋為1:20,取0.2ml加在1ml上述胰酶處理的膠乳中,于56℃水浴中致敏2小時(shí),再置于室溫下穩定4小時(shí)。

  對照膠乳用正常血清按上述條件致敏。

  ③影響制備炭疽抗血清膠乳的因素:為了防止聚苯乙烯膠乳自凝現象的出現和提高對抗血清的吸附并減少免疫膠乳的非特異反應,聚苯乙烯膠乳用胰酶處理后再致敏。而胰酶處理的膠乳要于3天內使用,否則吸附血清的能力明顯下降;致敏溫度對制備理想免疫膠乳有明顯影響,以56℃水浴致敏30分鐘為宜,低于45℃則發(fā)生不同程度的自凝;致敏的抗血清濃度過(guò)大,免疫膠乳的敏感性下降,濃度過(guò)低,則發(fā)生自凝,因此選擇合適的致敏抗血清濃度甚為重要。

  (2)直接致敏人IgG:類(lèi)風(fēng)濕因子(RF)是類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節炎患者血清中的一組異常的免疫球蛋白,能和IgG的FC部分呈特異性反應。將人IgG結合在膠乳微粒上,當與患者血清反應后,免疫膠乳即出現凝集反應,說(shuō)明患者血清中有類(lèi)風(fēng)濕因子。

  ①致敏方法:取10%聚苯乙烯膠乳1ml,加0. 1mol pH8.4甘氨酸緩沖液4ml,作1：5稀釋;另將人γ球蛋白稀釋為12.5mg/ml,二者等量相加,混均,在室溫放置過(guò)夜,加0.1%疊氮鈉防腐，即成類(lèi)風(fēng)濕因子免疫膠乳制劑。

  致敏膠乳不必洗滌,直接用于試驗。

  ②影響類(lèi)風(fēng)濕因子免疫膠乳質(zhì)量的因素:致敏用的γ球蛋白量要合適，γ球蛋白濃度過(guò)高，免疫膠乳容易發(fā)生自凝,過(guò)低則檢出的敏感性下降；免疫膠乳穩定性的關(guān)鍵是甘氨酸緩沖液中不含NaCl,否則致敏后數天,免疫膠乳就出現自凝;在檢測樣品時(shí),為了獲得良好結果,緩沖液中須含有0.85%NaCl;致敏時(shí),pH8. 4的甘氨酸緩沖液比pH8.2效果好。

  (2)羧基聚苯乙烯免疫膠乳的制備:羧基聚苯乙烯膠乳是以苯乙烯為基本單體,聚合反應的條件與聚苯乙烯膠乳基本相同,在反應的適當時(shí)機引入少量丙稀酸作為羧基的來(lái)源,通過(guò)聚合獲得羧基聚苯乙烯膠乳。

這種免疫膠乳,抗原或抗體是以化學(xué)鍵共價(jià)交聯(lián)在顆粒上的,這種化學(xué)結合比較牢固,而且結合的抗原或抗體量也比較多,特異性也較好,擴大了膠乳試驗的應用范圍。例如HCG-羧基膠乳,鏈球菌溶血素“O”-羧基聚苯乙烯膠乳等。關(guān)于制備免疫羧基聚苯乙烯膠乳的操作步驟,文獻報告均不夠詳細,總的來(lái)看,基本上采用兩步法,即第1步接“手臂”,第2步聯(lián)結抗原或抗體,今以制備羊抗兔IgG-羧基聚苯乙烯膠乳為例,將該法介紹如下。

  1.接“手臂"：取10%羧基膠乳1ml,加 0.2mol pH7.2磷酸鹽緩沖液1ml，0.025molε氨基乙酸2ml和碳化二乙胺4mg,室溫下輕輕攪拌2小時(shí).8000rpm離心30分鐘,去上清留沉淀。

  2.聯(lián)結抗體：上述膠乳用0.1mol pH7.6磷酸鹽緩沖液恢復至原體，加入羊抗兔IgG抗體2mg和碳化二乙胺6mg,在4℃冬件下輕輕攪拌6小時(shí)以上，離心去上清,用0.13molpH8.2硼酸緩沖液(含0.85%NaCl)洗1次,用同樣緩沖液恢復至原體積,即制成了羊抗兔IgG抗體-羧基聚苯乙烯膠乳。

【用途】

  膠乳凝集試驗因具有快速、簡(jiǎn)便和敏感、特異等優(yōu)點(diǎn),目前已廣泛的用于各種抗原和抗體的檢測。

【注意事項】

  1.膠乳懸液保存時(shí),放在4～6℃冰箱中,不能放在低溫冰箱使之凍結。

  2.本試驗易受pH的影響,在pH5.5～8.0的范圍內,膠乳顆粒易發(fā)生非特性凝集,使用的溶液pH在8.2～8.4較好。

  3.每批試驗應設置陰性對照和陽(yáng)性對照。

  4.如用玻片法時(shí)還應注意:

   ①不能搖的時(shí)間太長(cháng),時(shí)間過(guò)長(cháng),因蒸發(fā)的關(guān)系懸液邊緣出現干的凝膠,這容易誤判。一般于0.5～2分鐘而出現凝集。

   ②不能搖動(dòng)太劇烈,有些反應形成的凝集比較脆弱,劇烈的搖動(dòng)。會(huì )使已形成的凝集破壞。

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