水質(zhì)糞大腸菌群的測定濾膜法及結果分析

一、糞大腸菌群情況簡(jiǎn)要介紹

  糞大腸菌群，又稱(chēng)耐熱大腸菌群（thermotolerant coliforms），44.5℃培養24h，能在MFC選擇性培養基上生長(cháng)，發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，并形成藍色或藍綠色菌落的腸桿菌科細菌。

  該菌群來(lái)自人和溫血動(dòng)物糞便，作為糞便污染指標評價(jià)食品的衛生狀況，推斷食品中腸道致病菌污染的可能性。

二、參考標準

  《HJ347.1-2018水質(zhì)糞大腸菌群的測定濾膜法》點(diǎn)擊下載

三、檢驗原理

  樣品通過(guò)孔徑為0.45μm的濾膜過(guò)濾，細菌被截留在濾膜上，然后將濾膜置于MFC選擇性培養基上，在特定的溫度（44.5℃）下培養24h，膽鹽三號可抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(cháng)，糞大腸菌群能生長(cháng)并發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸使指示劑變色，通過(guò)顏色判斷是否產(chǎn)酸，并通過(guò)呈藍色或藍綠色菌落計數，測定樣品中糞大腸菌群濃度。

四、檢驗方法以及結果分析

  4.1 樣品

  4.1.1 樣品采集

  點(diǎn)位布設及采樣頻次按照GB/T14581、HJ/T494和HJ/T91的相關(guān)規定執行。采集微生物樣品時(shí)，采樣瓶不得用樣品洗滌，采集樣品于滅菌的采樣瓶中。樣品采集量可根據水體實(shí)際情況而定，一般不少于250mL。

  采集河流、湖庫等地表水樣品時(shí)，可握住瓶子下部直接將帶塞采樣瓶插入水中，約距水面10cm～15cm處，瓶口朝水流方向，拔瓶塞，使樣品灌入瓶?jì)热缓笊w上瓶塞，將采樣瓶從水中取出。如果沒(méi)有水流，可握住瓶子水平往前推。采樣量一般為采樣瓶容量的80%左右。樣品采集完畢后，迅速扎上無(wú)菌包裝紙。

  從龍頭裝置采集樣品時(shí)，不要選用漏水龍頭，采水前將龍頭打開(kāi)至最大，放水3min～5min，然后將龍頭關(guān)閉，用火焰灼燒約3min滅菌或用70%～75%的酒精對龍頭進(jìn)行消毒，開(kāi)足龍頭，再放水1min，以充分除去水管中的滯留雜質(zhì)。采樣時(shí)控制水流速度，小心接入瓶?jì)取?/span>

  采集地表水、廢水樣品及一定深度的樣品時(shí)，也可使用滅菌過(guò)的專(zhuān)用采樣裝置采樣。在同一采樣點(diǎn)進(jìn)行分層采樣時(shí)，應自上而下進(jìn)行，以免不同層次的攪擾。

  如果采集的是含有活性氯樣品，需在采樣瓶滅菌前加入硫代硫酸鈉溶液，以除去活性氯對細菌的抑制作用（每125mL容積加入0.1mL的硫代硫酸鈉溶液）；如果采集的是重金屬離子含量較高的樣品，則在采樣瓶滅菌前加入乙二胺四乙酸二鈉溶液，以消除干擾（每125mL容積加入0.3mL的乙二胺四乙酸二鈉溶液）。

  注：15.7mg硫代硫酸鈉可去除樣品中1.5mg活性氯，硫代硫酸鈉用量可根據樣品實(shí)際活性氯量調整。

  4.1.2 樣品保存

  采樣后應在2h內檢測，否則，應10℃以下冷藏但不得超過(guò)6h。實(shí)驗室接樣后，不能立即開(kāi)展檢測的，將樣品在4℃以下冷藏并在2 h內檢測。

  4.2 分析步驟 

  4.2.1 樣品過(guò)濾

  根據樣品的種類(lèi)判斷接種量，最小過(guò)濾體積為10mL，如接種量小于10mL時(shí)應逐級稀釋。

先估計出適合在濾膜上計數所使用的體積，然后再取這個(gè)體積的1/10和10倍，分別過(guò)濾。理想的樣品接種量是濾膜上生長(cháng)的糞大腸菌群菌落數為20個(gè)～60個(gè)，總菌落數不得超過(guò)200個(gè)。當最小過(guò)濾體積為10mL，濾膜上菌落密度仍過(guò)大時(shí)，則應對樣品進(jìn)行稀釋。1:10稀釋的方法為：吸取10mL樣品，注入盛有90mL無(wú)菌水的三角燒瓶中，混勻，制成1:10稀釋樣品。樣品接種量參考表見(jiàn)表1。

表1 接種量參考表

  用滅菌鑷子以無(wú)菌操作夾取無(wú)菌濾膜貼放在已滅菌的過(guò)濾裝置上，固定好過(guò)濾裝置，將樣品充分混勻后抽濾，以無(wú)菌水沖洗器壁2次～3次。樣品過(guò)濾完成后，再抽氣約5s，關(guān)上開(kāi)關(guān)。

  4.2.2 培養

  用滅菌鑷子夾取濾膜移放在MFC培養基上，濾膜截留細菌面向上，濾膜應與培養基完全貼緊，兩者間不得留有氣泡，然后將培養皿倒置，放入恒溫培養箱內，44.5℃±0.5℃培養24h±2h。

  MFC培養基檢驗原理：胰胨、多胨和酵母膏粉提供氮源、維生素和生長(cháng)因子；氯化鈉維持均衡的滲透壓；乳糖為可發(fā)酵糖類(lèi)；三號膽鹽抑制革蘭氏陽(yáng)性菌；瓊脂是培養基的凝固劑；玫紅酸和苯胺藍為pH指示劑。糞大腸菌群可在44.5℃條件下分解乳糖產(chǎn)酸，使培養基pH下降，菌落為亮藍色，其他不發(fā)酵乳糖的腸道菌菌落為無(wú)色、灰色或淡紅色。

  用法：稱(chēng)取本品52.3克，加熱煮沸溶解于1000mL蒸餾水中，冷卻至45℃-50℃時(shí)，傾入無(wú)菌平皿。無(wú)需高壓滅菌。

圖1 不同細菌在MFC瓊脂上的生長(cháng)特征

  4.2.3 對照試驗

  （1）空白對照

  每次試驗都要用無(wú)菌水按照步驟4.2.1和4.2.2進(jìn)行實(shí)驗室空白測定。

  （2）陽(yáng)性及陰性對照

  將糞大腸菌群的陽(yáng)性菌株（如大腸埃希氏菌Escherichia coli）和陰性菌株（如產(chǎn)氣腸桿菌Enterobacter aerogenes）制成濃度為40～600CFU/L的菌懸液，分別按照4.2.1～4.2.2步驟培養，陽(yáng)性菌株應呈現陽(yáng)性反應，陰性菌株應呈現陰性反應，否則，該次樣品測定結果無(wú)效，應查明原因后重新測定。

五、結果計算與表示

  5.1 結果判讀

  MFC培養基上呈藍色或藍綠色的菌落為糞大腸菌群菌落，予以計數。MFC培養基上呈灰色、淡黃色或無(wú)色的菌落為非糞大腸菌群菌落，不予計數。

  5.2 結果計算

  樣品中的糞大腸菌群數（CFU/L），按照下列公式進(jìn)行計算：

  式中：C——樣品中糞大腸菌群數，CFU/L；

  C₁——濾膜上生長(cháng)的糞大腸菌群菌落總數，個(gè)；

  1000——將過(guò)濾體積的單位由mL轉換為L(cháng)；

  f——樣品接種量，mL；

  注：若平行樣結果都在20～60CFU/L范圍內，最終結果取平均值以幾何平均計算。

  5.3 結果表示

  測定結果保留至整數位，最多保留兩位有效數字，當測定結果≥100 CFU/L時(shí)，以科學(xué)計數法表示。

六、注意事項：

  6.1 活性氯具有氧化性，能破壞微生物細胞內的酶活性，導致細胞死亡，可在樣品采集時(shí)加硫代硫酸鈉溶液消除干擾。

  6.2 重金屬離子具有細胞毒性，能破壞微生物細胞內的酶活性，導致細胞死亡，可在樣品采集時(shí)加入乙二胺四乙酸二鈉溶液消除干擾。

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