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一、大腸埃希氏菌情況簡(jiǎn)要介紹
大腸埃希氏菌（Escherichia coli，E. coli）為埃希氏菌屬（Escherichia）代表菌。一般多不致病，廣泛存在于人和溫血動(dòng)物的腸道中。
大腸埃希氏菌為革蘭氏陰性短桿菌，大小0.5×1~3微米。周生鞭毛，能運動(dòng)，無(wú)芽孢。能發(fā)酵多種糖類(lèi)產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，是人和動(dòng)物腸道中的正常棲居菌，嬰兒出生后即隨哺乳進(jìn)入腸道，與人終身相伴，幾乎占糞便干重的1/3。國家規定，每毫升飲用水中的菌落總數小于100，每100毫升水中不得檢出總大腸菌群。
二、參考標準
《GBT5750.12-2006生活飲用水標準檢驗方法微生物指標：大腸埃希氏菌》點(diǎn)擊下載
三、檢驗方法以及結果分析
3.1大腸埃希氏菌多管發(fā)酵法
大腸埃希氏菌多管發(fā)酵法是指多管發(fā)酵法總大腸菌群陽(yáng)性，在含有熒光底物的培養基上44.5℃培養24 h產(chǎn)生葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase），分解熒光底物釋放出熒光產(chǎn)物，使培養基在紫外光下產(chǎn)生特征性熒光的細菌，以此來(lái)檢測水中大腸埃希氏菌的方法。
3.1.1 檢驗步驟
3.1.1.1 乳糖發(fā)酵試驗
（1）取10mL水樣接種到10mL雙料乳糖蛋白胨培養液中，取1mL水樣接種到10mL單料乳糖蛋白胨培養液中，另取1mL水樣注入到9mL滅菌生理鹽水中，混勻后吸取1mL（即0.1mL水樣）注入到10mL單料乳糖蛋白胨培養液中，每一稀釋度接種5管。
對已處理過(guò)的出廠(chǎng)自來(lái)水，需經(jīng)常檢驗或每天檢驗一次的，可直接種5份10mL水樣雙料培養基，每份接種10mL水樣。
檢驗水源水時(shí)，如污染較嚴重，應加大稀釋度，可接種1、0.1、0.01mL甚至0.1、0.01、0.001mL，每個(gè)稀釋度接種5管，每個(gè)水樣共接種15管。接種1mL以下水樣時(shí)，必須作10倍遞增稀釋后，取1mL接種，每遞增稀釋一次，換用1支1mL滅菌刻度吸管。
（2）將接種管置36℃±1℃培養箱內，培養24h±2h。如有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，則按下列步驟進(jìn)行。
圖1 乳糖蛋白胨培養基微生物質(zhì)控結果
3.1.1.2 EC-MUG培養基試驗
用燒灼滅菌的金屬接種環(huán)或無(wú)菌棉簽將上述試管中液體接種到EC-MUG管中。將已接種的EC-MUG管在培養箱或恒溫水浴中44.5℃±0.5℃培養24h±2h。如使用恒溫水浴，在接種后30min內進(jìn)行培養，使水浴的液面超過(guò)EC-MUG管的液面。
3.1.2 結果觀(guān)察與報告
將培養后的EC-MUG管在暗處用波長(cháng)為366nm功率為6W的紫外光燈照射，如果有藍色熒光產(chǎn)生則表示水樣中含有大腸埃希氏菌。
圖2 EC-MUG培養基微生物質(zhì)控結果
計算EC-MUG陽(yáng)性管數，查對應的最可能數（MPN）表（表1或表2）得出大腸埃希氏菌的最可能數，結果以MPN/100mL報告。
表1 大腸埃希氏菌（MPN）檢索表（部分）
（總接種量55.5mL，其中5份10mL水樣、5份1mL水樣、5份0.1mL水樣）
表2 用5份10 mL水樣時(shí)各種陽(yáng)性和陰性結果組合時(shí)的最可能數（MPN）
3.2大腸埃希氏菌濾膜法
用濾膜法檢測水樣后，將總大腸菌群陽(yáng)性的濾膜在含有熒光底物的培養基上培養，能產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶分解熒光底物釋放出熒光產(chǎn)物，使菌落能夠在紫外光下產(chǎn)生特征性熒光，以此來(lái)檢測水中大腸埃
3.2.1 檢驗步驟
（1）準備工作
濾膜滅菌：將濾膜放入燒杯中，加入蒸餾水，置于沸水浴中煮沸滅菌3次，每次15min。前兩次煮沸后需更換水洗滌2次～3次，以除去殘留溶劑。
濾器滅菌：用點(diǎn)燃的酒精棉球火焰滅菌。也可用蒸汽滅菌器103.43kPa（121℃）高壓滅菌20min。
（2）過(guò)濾水樣
用無(wú)菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣部分，將粗糙面向上，貼放在已滅菌的濾床上，固定好濾器，將100mL水樣（如水樣含菌數較多，可減少過(guò)濾水樣量，或將水樣稀釋?zhuān)┳⑷霝V器中，打開(kāi)濾器閥門(mén)，在-5.07×104Pa（負0.5大氣壓）下抽濾。
（3）培養
水樣濾完后，再抽氣約5s，關(guān)上濾器閥門(mén)，取下濾器，用滅菌鑷子夾取濾膜邊緣部分，移放在品紅亞硫酸鈉培養基上，濾膜截留細菌面向上，濾膜應與培養基完全貼緊，兩者間不得留有氣泡，然后將平皿倒置，放入37℃恒溫箱內培養24h±2h。
（4）接種
挑取符合下列典型菌落生長(cháng)的濾膜進(jìn)行大腸埃希氏菌檢測。
紫紅色、具有金屬光澤的菌落；
深紅色、不帶或略帶金屬光澤的菌落；
淡紅色、中心色較深的菌落。
圖3 質(zhì)控菌株在品紅亞硫酸鈉培養基生長(cháng)情況
注：A：大腸埃希氏菌ATCC 25922；B：大腸埃希氏菌ATCC 8739；C：弗氏檸檬酸桿菌ATCC 43864；
D：鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC 14028；E：糞腸球菌ATCC 29212；
在無(wú)菌操作條件下將濾膜轉移到NA-MUG平板上，細菌截留面朝上，進(jìn)行培養。將已接種的NA-MUG平板36℃±1℃培養4 h。
3.2.2 結果觀(guān)察與報告
將培養后的NA-MUG平板在暗處用波長(cháng)為366nm功率為6W的紫外光燈照射，如果菌落邊緣或菌落背面有藍色熒光產(chǎn)生則表示水樣中含有大腸埃希氏菌。
圖4 質(zhì)控菌株在NA-MUG培養基生長(cháng)情況
注：A：大腸埃希氏菌ATCC 25922；B：大腸埃希氏菌ATCC 8739；
C：大腸埃希氏菌CMCC(B) 44102；D：鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC 14028；
記錄有藍色熒光產(chǎn)生的菌落數，按下列公式計算濾膜上生長(cháng)的大腸埃希氏菌數，以每100mL水樣中的大腸埃希氏菌（CFU/100mL）報告。
3.3大腸埃希氏菌酶底物法
在選擇性培養基上能產(chǎn)生β-半乳糖甘酶（β-D-galactosidase）分解色原底物釋放出色原體使培養基呈現顏色變化，并能產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase）分解熒光底物釋放出熒光產(chǎn)物，使菌落能夠在紫外光下產(chǎn)生特征性熒光；以此技術(shù)來(lái)檢測大腸埃希氏菌的方法為大腸埃希氏菌酶底物法。
3.3.1 檢驗步驟
（1）水樣稀釋
檢測所需水樣為100mL。若水樣污染嚴重，可對水樣進(jìn)行稀釋。取10mL水樣加入到90mL滅菌生理鹽水中，必要時(shí)可加大稀釋度。
（2）定性反應
用100mL的無(wú)菌稀釋瓶量取100mL水樣，加入2.7g±0.5g的MMO-MUG培養基粉末，混搖均勻使之完全溶解后，放入36℃±1℃的培養箱內培養24h。
（3）10管法
用100mL的無(wú)菌稀釋瓶量取100mL水樣，加入2.7g±0.5g的MMO-MUG培養基粉末，混搖均勻使之完全溶解。
準備10支15mm×10cm或適當大小的滅菌試管，用無(wú)菌吸管分別從前述稀釋瓶中吸取10mL水樣至各試管中，放入36℃±1℃的培養箱中培養24h。
（4）51孔定量盤(pán)法
用100mL的無(wú)菌稀釋瓶量取100mL水樣，加入2.7g±0.5g的MMO-MUG培養基粉末，混搖均勻使之完全溶解。
將前述100mL水樣全部倒入51孔無(wú)菌定量盤(pán)內，以手撫平定量盤(pán)背面以趕除孔穴內氣泡，然后用程控定量封口機封口。放入36℃±1℃的培養箱中培養24h。
圖5 51孔定量盤(pán)
3.3.2 結果報告
（1）結果判讀
將水樣培養24h后進(jìn)行結果判讀，如果結果為可疑陽(yáng)性，可延長(cháng)培養時(shí)間到28h進(jìn)行結果判讀，超過(guò)28h之后出現的顏色反應不作為陽(yáng)性結果。
對照表同表3與表4，水樣變黃色同時(shí)有藍色熒光判斷為大腸埃希氏菌陽(yáng)性，水樣未變黃色而有熒光產(chǎn)生不判定為大腸埃希氏菌陽(yáng)性。
圖6 質(zhì)控菌株在MMO-MUG培養基中生長(cháng)情況
A：大腸埃希氏菌ATCC 25922；B：陰溝腸桿菌ATCC 23355；C：弗氏檸檬鹽桿菌ATCC 43864；
D：肺炎克雷伯氏菌ATCC 10031；E：鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC 14028；
（2）定性反應
將經(jīng)過(guò)24h培養顏色變成黃色的水樣在暗處用波長(cháng)為366nm的紫外光燈照射，如果有藍色熒光產(chǎn)生判斷為陽(yáng)性反應，表示水中含有大腸埃希氏菌。水樣未產(chǎn)生藍色熒光判斷為陰性反應。結果以大腸埃希氏菌檢出或未檢出報告。
（3）10管法
將培養24h顏色變成黃色的水樣的試管在暗處用波長(cháng)為366nm的紫外光燈照射，如果有藍色熒光產(chǎn)生則表示有大腸埃希氏菌存在。
計算有熒光反應的試管數，對照表3查出其代表的大腸埃希氏菌最可能數。結果以MPN/100mL表示。如所有管未產(chǎn)生熒光，則可報告為大腸埃希氏菌未檢出。
表3 10管法不同陽(yáng)性結果的最可能數（MPN）及95%可信范圍（部分）
（4）51孔定量盤(pán)法
將培養24h顏色變成黃色的水樣的定量盤(pán)在暗處用波長(cháng)為366nm的紫外光燈照射，如果有藍色的熒光產(chǎn)生則表示該定量盤(pán)孔穴中含有大腸埃希氏菌。
計算有熒光反應的孔穴數，對照表4查出其代表的大腸埃希氏菌最可能數。結果以MPN/100mL表示。如所有孔未產(chǎn)生熒光，則可報告為大腸埃希氏菌未檢出。
表4 51孔定量盤(pán)法不同陽(yáng)性結果的最可能數（MPN）及95%可信范圍（部分）
相關(guān)標準：
GBT5750.12-2006 生活飲用水標準檢驗方法微生物指標 點(diǎn)擊下載
注:本文屬海博生物原創(chuàng ),未經(jīng)允許不得轉載。
