氧化酶試驗的操作方法及注意要點(diǎn)

一、試驗簡(jiǎn)介

  氧化酶又名細胞色素氧化酶、細胞色素氧化酶c或呼吸酶。通過(guò)氧化酶試驗可檢測細菌是否能產(chǎn)生該酶，主要用于腸桿菌科細菌與假單胞菌的鑒別，前者為陰性，后者為陽(yáng)性。奈瑟菌屬、莫拉菌屬細菌也呈陽(yáng)性反應。

二、試驗原理

  氧化酶為細胞色素呼吸酶系統的終末呼吸酶，氧化酶先使細胞色素c氧化，然后此氧化型細胞色素c再使對苯二胺氧化，生成有顏色的化合物，從而表現為顏色反應。

三、試劑

  1%鹽酸四甲基對苯二胺或1%鹽酸二甲基對苯二胺。

四、試驗方法

  常用方法有以下幾種：

  （1）菌落法：直接滴加試劑于被檢菌落上。具體操作為，取37℃培養20 h的斜面培養物一支，將2～3滴試劑從斜面上端滴下，并將斜面略加傾斜，使試劑流經(jīng)斜面上的培養物。如系平板培養物，則可將試劑滴在菌落上。

  （2）濾紙法：取一小塊潔凈濾紙，沾取少量菌，然后滴加試劑。

  （3）試劑紙片法：將濾紙片浸泡于試劑中制成試劑紙片，刮取菌苔涂于試劑紙上。

  其操作手法如圖1所示：

圖1  紙片法進(jìn)行氧化酶試驗的操作手法

  （4）拭子法：拭子應浸入試劑中，然后與可疑的分離菌落接觸，在10秒鐘內注意顏色的變化。

  （5）試管法：取18-24 h的營(yíng)養肉湯（4.5mL）新鮮細菌培養物。加入試劑（0.2mL），搖動(dòng)試管，以確�；旌衔锍浞只旌�，觀(guān)察顏色變化。

五、試驗結果

  細菌與試劑接觸后，在10秒內呈深紫色，為強陽(yáng)性；于2min內呈現藍色者為陽(yáng)性；陽(yáng)性培養物大多數于半分鐘內出現強陽(yáng)性反應，2min以后出現微弱或可疑反應均判為陰性結果。

  為保證結果準確性，分別以銅綠假單胞菌和大腸埃希氏菌作陽(yáng)性和陰性對照。

六、注意事項

  （1）進(jìn)行測試時(shí)，試劑可能會(huì )自動(dòng)氧化，因此使用新鮮試劑至關(guān)重要。為保證試劑新鮮，從配制到使用不應超過(guò)一周。

  （2）純化菌時(shí)，要選擇不含過(guò)多糖類(lèi)的培養基，如營(yíng)養瓊脂和胰蛋白酶大豆瓊脂。培養基中高濃度的葡萄糖會(huì )導致假陽(yáng)性結果。

  （3）如果被測微生物在含有染料的培養基上生長(cháng)，則結果可能會(huì )異常。

  （4）在將試劑添加到活性培養物中之前，請先將培養物進(jìn)行傳代培養，因為某些試劑會(huì )殺死微生物。

  （5）氧化酶測試有助于鑒定奈瑟菌以及鑒定和區分革蘭氏陰性桿菌。為了確定被測生物的革蘭氏反應和形態(tài)，應使用革蘭氏染色進(jìn)行檢查。

  （6）刮取菌苔一定要使用鉑金環(huán)、一次性塑料接種環(huán)或玻璃棒。使用包含鐵的環(huán)可能會(huì )導致假陽(yáng)性結果。

  （7）如果所用試劑或試劑條的敏感性較低，則可能會(huì )導致假陰性結果。

  （8）試紙條上滴加無(wú)菌水時(shí)，以剛剛浸濕為宜。若加水太多，會(huì )影響反應效果，延長(cháng)反應時(shí)間，或無(wú)顏色反應，造成假陰性（如圖2）。

左：10 uL              右：20 uL

圖2  不同用量的無(wú)菌水對氧化酶試驗結果的影響

  （9）確保用于氧化酶測試的菌落菌齡為18至24小時(shí)。較老的菌落，則會(huì )導致反應較弱甚至不反應（如圖3）。

左：24h菌苔            右：2周菌苔

圖3  不同菌齡的菌苔對氧化酶試驗結果的影響

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