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一、參考標準
《GB4789.44-2020食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 創(chuàng )傷弧菌檢驗》點(diǎn)擊下載
二、簡(jiǎn)介
1、生物學(xué)特征：創(chuàng )傷弧菌（Vibrio vulnificus）是一種海洋弧菌。形態(tài)：革蘭氏陰性弧菌，在液體培養基中菌體大小為0.7*2-3 μm，稍彎曲；在固體培養基中呈多樣性，有極端單鞭毛。培養特性：營(yíng)養要求一般，最適生長(cháng)溫度為30℃，兼性厭氧；在無(wú)NaCl及超過(guò)8%NaCl的培養基中不生長(cháng)，可在0.5%NaCl及3%NaCl的蛋白胨水中生長(cháng)，在含6%NaCl的蛋白胨水中生長(cháng)良好。
2、流行病學(xué)特點(diǎn)：創(chuàng )傷弧菌廣泛分布在海水中，可從牡蠣等海產(chǎn)品中分離得到。本菌主要通過(guò)傷口接觸海水造成感染，也可經(jīng)口感染。經(jīng)傷口感染時(shí)可導致蜂窩織炎及骨髓炎等多種炎癥，經(jīng)口感染時(shí)常迅速導致菌血癥或敗血癥。感染本菌后如不及時(shí)治療，病死率很高。
三、檢驗程序
四、操作步驟
1.樣品制備
以無(wú)菌操作取處理后的樣品25g，加入蛋白胨-氯化鈉-纖維素二糖-多黏菌素E（PNCC）增菌液225mL，用均質(zhì)器均質(zhì)2min，充分混勻制備成1:10的樣品勻液。
注意：新鮮樣品采集后應于3h內完成檢驗，若不能在規定時(shí)間內完成，則將樣品置于7℃-10℃條件下保存（因創(chuàng )傷弧菌在4℃條件下極易形成活而不可培養的狀態(tài)，因此樣品勿放4℃條件下），并盡可能在24h內完成檢驗；冷凍樣品應在不超過(guò)45℃的溫熱條件下解凍，解凍時(shí)間不超過(guò)15min。
2.增菌
將制備的1:10樣品勻液于36℃±1℃培養18h±1h。結果如圖2所示：
圖2 PNCC增菌液培養結果
3.PCR檢測
4.分離
用10μL接種環(huán)在距離PNCC增菌液的液面下1cm沾取一環(huán)增菌液，分別劃線(xiàn)接種于纖維素二糖-多黏菌素E（CC）和改良纖維二糖-多黏菌素B-多黏菌素E（mCPC）瓊脂培養基平板，于36℃±1℃條件下培養18h±1h。
典型的創(chuàng )傷弧菌可以發(fā)酵纖維二糖產(chǎn)酸使培養基變黃，所以在CC和mCPC平板上的形態(tài)為：圓形、扁平，光照下呈透明或中心不透明但邊緣透明的黃色至橘黃色菌落，菌落直徑1mm~2mm，菌落周?chē)沙霈F（或不出現）黃色暈圈。結果如圖3所示：
圖3 創(chuàng )傷弧菌CICC 10383在CC和mCPC瓊脂培養基平板上的培養結果
5.分純培養
從CC平板和mCPC平板上各挑取至少5個(gè)創(chuàng )傷弧菌可疑菌落（少于5個(gè)時(shí)全選），分別接種于3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板，36℃±1℃培養18h±1h后用于后續鑒定。
創(chuàng )傷弧菌在3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上的菌落形態(tài)為：圓形、乳白色、濕潤、隆起、直徑1mm~2mm。結果如圖4所示：
圖4 創(chuàng )傷弧菌CICC 10383在3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上的培養結果
6.鑒定
創(chuàng )傷弧菌可采用菌落特征結合生化特性或PCR方法進(jìn)行鑒定。
6.1 菌落特征及生化特性
6.1.1 初步鑒定
該步驟用于創(chuàng )傷弧菌的初步鑒定，進(jìn)行以下4項鑒定實(shí)驗時(shí)，挑取的菌落應來(lái)自分純后的同一個(gè)單菌落。
（1）革蘭氏染色鏡檢：從分純培養的3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上挑取創(chuàng )傷弧菌疑似菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。
創(chuàng )傷弧菌為革蘭氏陰性，顯微鏡下菌體為棒狀、弧狀、卵圓狀等多種形態(tài)，無(wú)芽胞，如圖5所示：
圖5 革蘭氏染色結果
（2）氧化酶試驗：用接種環(huán)挑取從分純培養的3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上挑取創(chuàng )傷弧菌疑似菌落適量涂在蒸餾水潤濕的氧化酶試紙上，在10 s內變?yōu)樗{色或藍紫色為陽(yáng)性，2 min內不變色為陰性。
創(chuàng )傷弧菌在氧化酶試紙上顯藍色，為陽(yáng)性。結果如圖6所示：
圖6 氧化酶試驗結果
注：a：創(chuàng )傷弧菌CICC 10383；b：大腸埃希氏菌ATCC 25922
（3）三糖鐵試驗：用接種針從分純培養的3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上挑取創(chuàng )傷弧菌疑似菌落適量，轉種于3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面并穿刺底層（注意接種針不要觸及試管底部），36℃±1℃培養24h，觀(guān)察結果。
創(chuàng )傷弧菌可以發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，使斜面變黃，但因接觸空氣而氧化，加之細菌生長(cháng)利用培養基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故斜面后來(lái)又變紅。底部由于厭氧狀態(tài)，酸類(lèi)不被氧化，仍保持黃色。所以在3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面中生長(cháng)時(shí)試管底層變黃，無(wú)氣泡，斜面顏色不變黃。結果如圖7所示：
圖7 3%氯化鈉三糖鐵瓊脂培養結果
注：a：空白對照；b：創(chuàng )傷弧菌CICC 10383
（4）嗜鹽性試驗：用接種針從分純培養的3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上挑取創(chuàng )傷弧菌疑似菌落分別接種于含有0%、3%、6%、8%、和10%氯化鈉的胰蛋白胨水中，36℃±1℃培養24h，觀(guān)察液體的混濁情況。
創(chuàng )傷弧菌在含有0%、8%、和10%氯化鈉的胰蛋白胨水中不生長(cháng)或微弱生長(cháng)，胰蛋白胨水澄清透亮或稍混濁，而在3%和6%氯化鈉的胰蛋白胨水中生長(cháng)旺盛，胰蛋白胨水混濁。結果如圖8所示：
圖8 胰蛋白胨水培養結果
6.1.2 確證實(shí)驗
將初步鑒定為創(chuàng )傷弧菌的疑似菌落接種在3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上，36℃±1℃培養18h±1h后，取純培養物分別接種于含3%氯化鈉的賴(lài)氨酸脫酸酶試驗培養基和MR-VP培養基中，36℃±1℃培養24h~48h后觀(guān)察結果；
另取少許純培養物接種于3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面，36℃±1℃培養18h后用于ONPG試驗。結果如圖9所示：
圖9 確證試驗結果
注：a：對照；b：創(chuàng )傷弧菌CICC 10383
7.結果與報告
根據菌落特征、生化特征或PCR鑒定結果，報告25g樣品中檢出或未檢出創(chuàng )傷弧菌。
相關(guān)標準:
GB 4789.44-2020 食品微生物學(xué)檢驗 創(chuàng )傷弧菌檢驗 點(diǎn)擊下載
相關(guān)產(chǎn)品：
蛋白胨-氯化鈉-纖維二糖-多粘菌素E(PNCC)增菌液-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情
纖維二糖-多粘菌素E（CC）瓊脂-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情
3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情
3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂（9cm）-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情
3%氯化鈉三糖鐵(TSI)瓊脂-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情
3%氯化鈉賴(lài)氨酸脫羧酶-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情
3%NaCl ONPG-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情
注:本文屬海博生物原創(chuàng ),未經(jīng)允許不得轉載。
