生活飲用水中耐熱大腸菌群檢驗方法及結果分析

一、耐熱大腸菌群情況簡(jiǎn)要介紹

  耐熱大腸菌群的定義：用提高培養溫度的方法將自然環(huán)境中的大腸菌群與糞便中的大腸菌群區分開(kāi)，在44.5℃仍能生長(cháng)的大腸菌群，稱(chēng)為耐熱大腸菌群。

  通常情況下，耐熱大腸菌群與大腸菌群相比，在人和動(dòng)物糞便中所占的比例較大，而且由于在自然界容易死亡等原因，耐熱大腸菌群的存在可認為食品直接或間接的受到了比較近期的糞便污染。因而，耐熱大腸菌群在食品中的檢出，與大腸菌群相比，說(shuō)明食品受到了更為不清潔的加工，腸道致病菌和食物中毒菌的可能性更大。

二、參考標準

  《GBT5750.12-2006生活飲用水標準檢驗方法微生物指標：耐熱大腸菌群》 點(diǎn)擊下載

三、檢驗方法以及結果分析

  3.1多管發(fā)酵法

  根據耐熱大腸菌群具有的生物特性，在44.5℃培養24 h能發(fā)酵乳糖并產(chǎn)氣的特點(diǎn)，將不同量的水樣接種到含乳糖的培養基中，經(jīng)培養后根據陽(yáng)性反應結果可測出原水樣中耐熱大腸菌群的最可能數（MPN）。

  3.1.1 檢驗步驟

  3.1.1.1 乳糖發(fā)酵試驗

  （1）取10mL水樣接種到10mL雙料乳糖蛋白胨培養液中，取1mL水樣接種到10mL單料乳糖蛋白胨培養液中，另取1mL水樣注入到9mL滅菌生理鹽水中，混勻后吸取1mL（即0.1mL水樣）注入到10mL單料乳糖蛋白胨培養液中，每一稀釋度接種5管。

  對已處理過(guò)的出廠(chǎng)自來(lái)水，需經(jīng)常檢驗或每天檢驗一次的，可直接種5份10mL水樣雙料培養基，每份接種10mL水樣。

  檢驗水源水時(shí)，如污染較嚴重，應加大稀釋度，可接種1、0.1、0.01mL甚至0.1、0.01、0.001mL，每個(gè)稀釋度接種5管，每個(gè)水樣共接種15管。接種1mL以下水樣時(shí)，必須作10倍遞增稀釋后，取1mL接種，每遞增稀釋一次，換用1支1mL滅菌刻度吸管。

  （2）將接種管置36℃±1℃培養箱內，培養24 h±2 h。

圖1 耐熱大腸菌群在乳糖蛋白胨培養液中生長(cháng)特征

  （3）從陽(yáng)性管（產(chǎn)酸產(chǎn)氣）中取1滴轉種于EC培養基中，置44.5℃水浴箱或隔水式恒溫培養箱內（水浴箱的水面應高于試管中培養基液面），培養24h±2h，如所有管均不產(chǎn)氣，則可報告為陰性。

圖2 耐熱大腸菌群在EC培養基中生長(cháng)特征

  如有產(chǎn)氣者，則轉種于伊紅美藍瓊脂平板上，置44.5℃培養18 h～24 h觀(guān)察菌落形態(tài)。凡平板上有以下典型菌落者，則證實(shí)為耐熱大腸菌群陽(yáng)性：

  深紫黑色、具有金屬光澤的菌落；

  紫黑色、不帶或略帶金屬光澤的菌落；

  淡紫紅色、中心較深的菌落。

圖3 耐熱大腸菌群在伊紅美藍瓊脂培養基中生長(cháng)特征

  （4）如檢測未經(jīng)氯化消毒的水，且只想檢測耐熱大腸菌群時(shí)，或調查水源水的耐熱大腸菌群污染時(shí)，可用直接多管耐熱大腸菌群方法，即在第一步乳糖發(fā)酵試驗時(shí)按照步驟（1）接種乳糖蛋白胨培養液在44.5℃±0.5℃水浴中培養，以下步驟同步驟（3）。

  3.1.2 結果報告

  根據證實(shí)為耐熱大腸菌群的陽(yáng)性管數，查本標準中總大腸菌群最可能數（MPN）檢索表，報告每100 mL水樣中耐熱大腸菌群的最可能數（MPN）值。

表1 耐熱大腸菌群（MPN）檢索表（部分）

（總接種量55.5mL，其中5份10mL水樣、5份1mL水樣、5份0.1mL水樣）

  3.2濾膜法

  耐熱大腸菌群濾膜法是指用孔徑為0.45μm的濾膜過(guò)濾水樣，細菌被阻留在膜上，將濾膜貼在加乳糖的選擇性培養基上，44.5℃培養24h能形成特征性菌落以此來(lái)檢測水中耐熱大腸菌群的方法。

  3.2.1 檢驗步驟

  （1）準備工作

  濾膜滅菌：將濾膜放入燒杯中，加入蒸餾水，置于沸水浴中煮沸滅菌3次，每次15min。前兩次煮沸后需更換水洗滌2次～3次，以除去殘留溶劑。

  濾器滅菌：用點(diǎn)燃的酒精棉球火焰滅菌。也可用蒸汽滅菌器103.43kPa（121℃）高壓滅菌20min。

  （2）過(guò)濾水樣

  用無(wú)菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣部分，將粗糙面向上，貼放在已滅菌的濾床上，固定好濾器，將100mL水樣（如水樣含菌數較多，可減少過(guò)濾水樣量，或將水樣稀釋?zhuān)┳⑷霝V器中，打開(kāi)濾器閥門(mén)，在-5.07×10⁴Pa（負0.5大氣壓）下抽濾。

  （3）培養

  水樣濾完后，再抽氣約5s，關(guān)上濾器閥門(mén)，取下濾器，用滅菌鑷子夾取濾膜邊緣部分，移放在MFC培養基上，濾膜截留細菌面向上，濾膜應與培養基完全貼緊，兩者間不得留有氣泡，然后將平皿倒置，放入37℃恒溫箱內培養24h±2h。如使用恒溫水浴，則需用塑料平皿，將皿蓋緊，或用防水膠帶貼封每個(gè)平皿，將培養皿成疊封入塑料袋內，浸到44.5℃恒溫水浴里，培養24h±2h。耐熱大腸菌群在此培養基上菌落為藍色，非耐熱大腸菌群菌落為灰色至奶油色。

圖4 耐熱大腸菌群在MFC培養基上的菌落特征

  （4）對可疑菌落轉種EC培養基，44.5℃培養24h±2h，如產(chǎn)氣則證實(shí)為耐熱大腸菌群。

  3.2.2 結果報告

  計數被證實(shí)的耐熱大腸菌落數，水中耐熱大腸菌群數系以100mL水樣中耐熱大腸菌群菌落形成單位（CFU）表示，見(jiàn)下列公式：

  耐熱大腸菌菌落數（CFU/100mL）=所計得的耐熱大腸菌菌落數×100過(guò)濾水樣體積 

相關(guān)標準：

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