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一、銅綠假單胞菌情況簡(jiǎn)要介紹
銅綠假單胞菌（拉丁文名Pseudomonas aeruginosa）廣泛分布于水、空氣、土樣以及正常人體皮膚、呼吸道與腸道黏膜中，為條件致病菌。本菌為無(wú)莢膜、無(wú)芽孢、能運動(dòng)的革蘭陰性菌，形態(tài)不一，成對排列或短鏈狀，為專(zhuān)性需氧菌，最適宜生長(cháng)溫度為37℃，致病性銅綠假單胞菌該菌在4℃不生長(cháng)而在42℃可以生長(cháng)，據此可與熒光假單胞菌等進(jìn)行鑒別，本菌生長(cháng)對營(yíng)養要求不高。
本菌為條件致病菌，是醫院內感染的主要病原菌之一�；即x性疾病、血液病和惡性腫瘤的患者，以及術(shù)后或某些治療后的患者易感染本菌。經(jīng)常引起術(shù)后傷口感染，也可引起褥瘡、膿腫、化膿性中耳炎等。本菌引起的感染病灶可導致血行散播，而發(fā)生菌血癥和敗血癥。燒傷后感染了銅綠色假單胞菌可造成死亡。
二、參考標準
《GB8538-2016 飲用天然礦泉水：銅綠假單胞菌檢驗》
三、檢驗原理
采用濾膜法，將250mL水樣用孔徑為0.45μm的濾膜過(guò)濾，并將濾膜移至CN瓊脂培養基上，于36℃±1℃恒溫箱中培養48h，典型菌落能夠在CN瓊脂選擇性培養基上生長(cháng)并產(chǎn)生綠膿菌素，或者能夠在溴化十六烷基三甲銨選擇性培養基上生長(cháng)并且氧化酶呈陽(yáng)性、紫外光360nm±20nm照射下能發(fā)熒光，能夠利用乙酰胺產(chǎn)氨的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌，經(jīng)證實(shí)為銅綠假單胞菌，則其檢測結果為陽(yáng)性。
四、檢驗方法以及結果分析
銅綠假單胞菌檢驗程序見(jiàn)圖1。
圖1 銅綠假單胞菌檢驗程序
4.1操作步驟
4.1.1 水樣過(guò)濾
在100級的潔凈工作臺進(jìn)行過(guò)濾操作。首先用無(wú)菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣部分，將粗糙面向上，貼放在已滅菌的濾床上，固定好濾器，將250mL水樣或稀釋液通過(guò)孔徑0.45μm的濾膜過(guò)濾，然后將過(guò)濾后的濾膜貼在已制備好的CN瓊脂平板上，平鋪并避免在濾膜和培養基之間夾留著(zhù)氣泡。
4.1.2 培養
將平板倒置于36℃±1℃培養24h~48h，并防止干燥。
4.1.3 結果觀(guān)察
在培養20h~24h和40h~48h后觀(guān)察濾膜上菌落的生長(cháng)情況并計數。
銅綠假單胞菌在CN瓊脂平板上為藍綠色菌落，如下圖所示：
圖2 銅綠假單胞菌在CN瓊脂平板上的菌落特征
計數所有顯藍色或綠色（綠膿色素）疑似銅綠假單胞菌的菌落，并進(jìn)行綠膿菌素確證性試驗。
在紫外線(xiàn)下檢查濾膜時(shí)，應避免長(cháng)時(shí)間在紫外光下照射，否則可能會(huì )將平板上的菌落殺滅，而導致無(wú)法在證實(shí)培養基上生長(cháng)。計數濾膜上所有發(fā)熒光不產(chǎn)綠膿色素疑似銅綠假單胞菌菌落，并進(jìn)行乙酰胺肉湯確證性試驗。
將其他所有紅褐色不發(fā)熒光的菌落進(jìn)行氧化酶測試、乙酰胺液體培養基、金氏B培養基確證性試驗，培養20h~24h觀(guān)察結果，防止因為培養40h~48h導致菌落過(guò)分生長(cháng)而出現菌落融合。
最終的銅綠假單胞菌菌落計數應按4.4中的公式進(jìn)行計算。
在CN瓊脂上生長(cháng)的菌落選擇和驗證步驟見(jiàn)表1。
表1 在CN瓊脂上生長(cháng)的菌落選擇和驗證步驟
4.2 確證性試驗
4.2.1 營(yíng)養瓊脂
盡可能將所有經(jīng)濾膜過(guò)濾后，在36℃±1℃培養了20h~24h，將需驗證的可疑菌落劃線(xiàn)接種營(yíng)養瓊脂培養基，于36℃±1℃培養20h~24h。檢查再次純化的菌落，并將最初顯紅褐色的菌落進(jìn)行氧化酶試驗。
4.2.2 氧化酶試驗
取2滴~3滴新鮮配制的氧化酶試劑滴到放于平皿里的潔凈濾紙上，用鉑金絲接種環(huán)或玻璃棒，將適量的純種培養物涂布在預備好的濾紙上，在10s內顯深藍紫色的視為陽(yáng)性反應。
圖3 氧化酶試驗結果
備注：A：銅綠假單胞菌；B：陰性對照
4.2.3 金氏B（King's B）培養基
將上述呈紅褐色的且氧化酶反應呈陽(yáng)性的培養物接種于金氏B培養基上，于36℃±1℃恒溫箱培養24h~5d。每天需取出在紫外燈下檢查其是否產(chǎn)生熒光性，將5d內產(chǎn)生熒光的菌落記錄為陽(yáng)性。
圖4 金氏B培養基檢測結果
4.2.4 綠膿菌素試驗
取可疑菌落2個(gè)~3個(gè)，分別接種在綠膿菌素測定培養基上，置36℃±1℃培養24h±2h，加入三氯甲烷3mL~5mL，充分振蕩使培養物中的綠膿菌素溶解于三氯甲烷液內，待三氯甲烷提取液呈藍色時(shí)，用吸管將三氯甲烷移到另一試管中并加入1mol/L的鹽酸1mL左右，振蕩后，靜置片刻。如上層鹽酸液內出現粉紅色到紫紅色時(shí)為陽(yáng)性，表示被檢物中有綠膿菌素存在。
圖5 銅綠假單胞菌在綠膿菌素測定培養基中生長(cháng)情況
4.2.5 乙酰胺液體培養基
將4.2.1中的純培養物接種到裝有乙酰胺液體培養基的試管中，在36℃±1℃下培養20h~24h。然后向每支試管培養物加入1滴~2滴鈉氏試劑，檢查各試管的產(chǎn)氨情況，如表現出從深黃色到磚紅色的顏色變化，則為陽(yáng)性結果，否則為陰性。
圖6 銅綠假單胞菌乙酰胺液體培養基生長(cháng)情況
備注：A：大腸桿菌；B：銅綠假單胞菌ATCC 27853；C：銅綠假單胞菌ATCC 9027
4.3 計數
將產(chǎn)生綠膿色（藍色/綠色）或氧化酶反應呈陽(yáng)性、在紫外燈下產(chǎn)生熒光（4.1.3或4.2.3），且在乙酰胺肉湯中產(chǎn)氨的所有菌落證實(shí)為銅綠假單胞菌，并進(jìn)行計數。通過(guò)計數培養后的濾膜上的菌落以獲得銅綠假單胞菌的數量，其他呈紅褐色的菌落需要進(jìn)一步驗證。
4.4 結果與報告
濾膜上的特征菌落可證實(shí)為銅綠假單胞菌的菌落。計算菌落數時(shí)應考慮到驗證試驗的比例及特定的水量，過(guò)濾的水樣的體積應為250mL。
式中：
P —呈藍/綠色的菌落數；
F —顯熒光的菌落數；
cF—產(chǎn)氨陽(yáng)性的顯熒光菌落數；
nF—進(jìn)行產(chǎn)氨測試的顯熒光菌落數；
R —呈紅褐色的菌落數；
cR—產(chǎn)氨、氧化酶、金氏B培養基上顯熒光測試均呈陽(yáng)性的紅褐色菌落數；
nR—進(jìn)行產(chǎn)氨、氧化酶、金氏B培養基上顯熒光測試的紅褐色菌落數。
根據藍色或綠色菌落的計數（4.1.3）和確證性試驗的結果（4.2），計算每250mL水樣中的銅綠假單胞菌數量，結果以CFU/250mL計。
4.5 其他
如銅綠假單胞菌污染嚴重或培養時(shí)間過(guò)長(cháng)時(shí)，菌落可能蔓延而影響計數。
檢驗及計數過(guò)程中應以銅綠假單胞菌標準菌株作為陽(yáng)性對照菌株，以熒光假單胞菌標準菌株作為陰性對照菌株。
相關(guān)產(chǎn)品：
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綠膿菌素測定培養基（PDP）-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情
綠膿菌素測定培養基管（PDP）13ml-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情
相關(guān)標準：
GB 8538-2016 飲用天然礦泉水檢驗方法 點(diǎn)擊下載
注:本文屬海博生物原創(chuàng ),未經(jīng)允許不得轉載。
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