鱟試劑

【原理】

  鱟試劑( Tachypleus Amebocyte Lysate , TAL )是海洋節肢動(dòng)物鱟血液中的阿米巴細胞( Amebocyte )經(jīng)裂解液或機械方法裂解細胞后提取得到的一種細胞溶解物。鱟試劑中含有特異性的凝固酶,在一定條件下可被極微量的內毒素激活,當凝固蛋白原的精氨酸¹⁸-蘇氨酸¹⁹和精氨酸⁴⁶-甘氨酸⁴⁷之間的肽鍵被切斷后,則游離出含有28個(gè)氨基酸的C肽片段和凝固蛋白分子兩端的A肽和B肽片段,并通過(guò)二硫鍵聯(lián)結聚合成凝膠,其形成凝膠的速度和堅固程度與鱟試劑中凝固酶含量及內毒素濃度成正比。根據鱟試劑的這一特殊性質(zhì),可以方便、敏感地快速定性或定量檢測檢品中的內毒素含量。

【成分】

【制法】

  1. 采血:新鮮健康成年的中國鱟(Tachypleus tri-denatus Leach),頭胸-腹關(guān)節處以碘酒、酒精(70%)常規消毒,用16號獸用針頭或特制玻管行心臟穿刺,使鱟血流入盛有抗凝劑(20mmol/L茶堿或25mmol/L乙二胺四乙酸鈉, ED-TA比例為1:1(v/v)的無(wú)熱原收集瓶中;

  2. 離心和洗滌:采血后立即離心,600g,5分鐘,棄藍色上清，見(jiàn)白色粉末狀沉淀,加3.1%NaCI洗滌、離心兩次,600g,5分鐘,再次洗滌后進(jìn)行細胞計數;

  3. 裂解:將5×10⁴/mm³細胞懸液100ml沉淀后,其壓積細胞加入10ml裂解液(154mmol/L NaCl ,50mmol/L Tris-HCI pH7.1±0.3,10~100mmol/L CaCl₂),用力振蕩后置4℃冰箱見(jiàn)24~72小時(shí),取出2000g離心,15分鐘,所得上清即為粗制鱟試劑;

  4. 精制:氯仿抽提后加20mmol/L氯化鈣和154mmol/L氯化鈉鹽析,作敏感度檢測后分裝凍干保存。

【注意事項】

  1. 制備鱟試劑檢測內毒素所用器皿,如玻璃離心管、針頭、吸管、試管等,必須用酸、堿泡過(guò)后,250℃2小時(shí)或180℃4小時(shí)以上干烤,以徹底去除熱原;

  2. 所用藥品必須用干烤或活性炭吸附法等去除熱原,尤其所用水必須經(jīng)嚴格去熱原并用標準內毒素與鱟試劑檢測合格后方可使用;

  3. 加3.1%氯化鈉溶液洗滌細胞時(shí),應把玻璃管緩慢擺動(dòng)或旋轉,或用吸管沖洗,使沉淀(細胞)徐徐分散漂起,否則細胞破碎后易凝聚成塊;

  4. 裂解時(shí),加裂解液量不能按采血量加入,應按細胞壓積計算,因為不同鱟血中所含細胞數量相差懸殊;

  5. 鱟試劑在液態(tài)下極不穩定,應該凍干保存并冷藏于-30℃以下避光處。

【用途】

  鱟試劑主要用來(lái)檢測革蘭氏陰性細菌內毒素(熱原)。如用于腦脊液、尿液及血液中內毒素的檢測;此外鱟試劑在藥品、食品和水質(zhì)熱原檢測中也廣為應用,特別在家兔熱原試驗不能檢測的檢品中,如放射性藥品、具有細胞毒性的抗癌藥物等;用于基因工程產(chǎn)品的熱原檢測;是目前最靈敏、簡(jiǎn)便、可靠、快速而且能夠定量的檢測內毒素的理想試劑。根據我國衛生部(88)衛藥政字第259號通知,目前規定4種大輸液(注射用水、氯化鈉注射液,5%和10%葡萄糖注射液)必須通過(guò)鱟試驗檢查合格后方可應用于臨床。

  用鱟試劑檢測內毒素一般用試管凝膠法較為簡(jiǎn)便,靈敏度不亞于其它方法,其步驟大致如下:

  將檢品1:10梯度稀釋,用標準內毒素和超純水作陽(yáng)、陰性對照,并作自凝試驗,每管終量為0.1ml,再各加入0.1ml鱟試劑,充分搖勻,蓋上玻璃帽,放37℃水浴1小時(shí)觀(guān)察結果,并記錄各管凝聚時(shí)間。形成堅固凝膠不流動(dòng)者為++;混濁度和粘滯度均明顯增加,呈膠體狀傾斜試管可變形者為+;透明度無(wú)變化或稍混濁有少量顆粒絮片,液體流動(dòng)自如者為-;再根據凝聚時(shí)間可定量檢測檢品中熱原含量。

(第二軍醫大學(xué) 王梁華、焦炳華供稿)

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