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【原理】
聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺與N , N-次甲基雙丙烯酰胺(bis)在催化劑四甲基乙二胺(TEMED)和過(guò)硫酸銨作用下聚合而成,通過(guò)兩者濃度的改變可形成不同孔徑的篩孔,聚丙烯酰胺凝膠電泳兼有分子篩和電泳的雙重作用,能精細分離蛋白及核酸。十二烷基硫酸鈉(SDS)是陰離子去污劑,它與蛋白質(zhì)的疏水區相結合,可使蛋白呈一致的強負電荷,所以可增加聚丙烯酰胺凝膠電泳的分辨力。
【成分】
(1) A液:30%丙烯酰胺
|
丙烯酰胺 |
30g |
|
N, N-次甲基雙丙烯酰胺 |
0.8g |
|
加水至 |
100ml |
|
4℃避光保存 |
|
(2)B液:1.5mol Tris · HCl ,pH8.8。
(3)C液:10%SDS。
(4)D液:0.5mol Tris · HCl ,pH6.8。
(5)四甲基乙二胺(TEMED):原液。
(6)10%過(guò)硫酸胺:4℃保存,二星期內使用。
(7)電泳液:
|
Tris |
6g |
|
甘氨酸 |
28.8g |
|
10%SDS |
10ml |
|
加雙蒸餾水至 |
1000ml |
|
調至pH8.8 |
|
(8)染色液:
|
0.2%考馬斯藍 |
若干ml |
|
50%甲醇 |
若干ml |
|
7%乙酸 |
若干ml |
(9)脫色液:
|
50%甲醇 |
若干ml |
|
7%乙酸 |
若干ml |
(10)樣本緩沖液:
|
0.05mol Tris. HCl ,pH6.8 |
若干ml |
|
0. 1%SDS |
若干ml |
|
10%甘油 |
若干ml |
|
0.1%二巰基乙醇 |
若干ml |
|
0.002%溴酚藍 |
若干ml |
【制法】
1. 分離膠的配制:見(jiàn)表44—1。
2. 4%的樣品膠的配制(100ml):
|
A液 |
13.3ml |
|
B液 |
12.5ml |
|
C液 |
1.0ml |
|
雙蒸餾水 |
72.2ml |
|
TEMED |
50μl |
|
10%過(guò)硫酸銨 |
1.0μl |
表44—1聚丙烯酰胺凝膠(分離膠)的配制
|
凝膠濃度 |
2.5 |
5 |
7.5 |
10 |
13 |
15 |
20(100ml) |
|
A液(ml) |
8.3 |
16.7 |
25.0 |
33.3 |
43.3 |
50.0 |
66.7 |
|
B液(ml) |
12.5 |
12.5 |
12.5 |
12.5 |
12.5 |
12.5 |
12.5 |
|
C液(ml) |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
|
雙蒸餾水(ml) |
78.0 |
69.6 |
61.3 |
53.0 |
43.0 |
36.3 |
19.6 |
|
TEMED (μl) |
50.0 |
50.0 |
50.0 |
50.0 |
50.0 |
50.0 |
50.0 |
|
10%過(guò)硫酸銨(ml) |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
【用途】
聚丙烯酰胺凝膠電泳用于蛋白質(zhì)或核酸的純度、含量和分子量大小的鑒定和分析,也可用于蛋白質(zhì)、核酸的純化。其濃度與有效分辨率之間的關(guān)系見(jiàn)表44—2。
表44—2丙烯酰胺濃度及其有效分辨范圍
|
丙烯酰胺 濃度(%) |
有效分辨范圍 |
|
|
核甘酸數 |
蛋白分子量(道爾頓) |
|
|
3.5 |
100~1000 |
|
|
5.0 |
80~500 |
2.5~20.0X104 |
|
8.0 |
60~400 |
|
|
10.0 |
|
1.5~7.0X104 |
|
12.0 |
40~200 |
|
|
15.0 |
|
1.2~4.5X104 |
|
20.0 |
10~100 |
|
【注意事項】
1. 電泳過(guò)程中,電壓過(guò)高,會(huì )使凝膠發(fā)熱。一般以較低電壓,較長(cháng)時(shí)間的效果為好。
2. 丙烯酰胺是神經(jīng)毒物質(zhì),可經(jīng)呼吸道或皮膚進(jìn)入人體。實(shí)驗操作時(shí)要戴手套,避免用口吸取溶液。
3. 凝膠板在電泳槽中固定后,用丁形玻璃管趕走底部氣泡,至為重要。若有氣泡,則凝膠中的蛋白或核酸帶易產(chǎn)生彎曲。
4. 在進(jìn)行蛋白凝膠電泳時(shí),必須用已知分子量大小的蛋白作為分子量標記,同時(shí)進(jìn)行電泳。常用的分子量標記為:
|
卵白蛋白 |
43000道爾頓 |
|
α-糜蛋白酶原 |
25700道爾頓 |
|
β-乳球蛋白 |
18400道爾頓 |
|
溶菌酶 |
14300道爾頓 |
|
細胞色素C |
12300道爾頓 |
|
牛胰蛋白酶抑制物 |
6200道爾頓 |
|
胰島素(A和B鏈) |
～3000道爾頓 |
(第二軍醫大學(xué) 劉滬麗供稿全章 由第二軍醫大學(xué) 謝正旸審編)
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