一、菌株概念及傳代
（1）標準菌株：直接從官方菌種保藏機構獲得并至少定義到屬或種的水平的菌株。通常默認為第0代菌株。
（2）標準儲備菌株：將標準菌株在實(shí)驗室轉接一代后得到的一套完全相同的獨立菌株。通常為第1代或第2代菌株。
（3）儲備菌株：從標準儲備菌株轉接一代獲得的培養物。通常為第2代或第3代菌株。
（4）工作菌株：由標準儲備菌株、 儲備菌株或標準物質(zhì)（經(jīng)證明或未經(jīng)證明） 轉接一代獲得的菌株。通常為第3-5代菌。
傳代：每一次的轉接培養都是一次傳代的過(guò)程，可以使用液體、固體或半固體培養基。
注意事項：菌株傳代只能由上往下傳，儲備菌株可以做為工作菌株使用，但工作菌株不能做為儲備菌株使用。實(shí)驗室使用的工作菌株一般不可超過(guò)第5代，除非標準方法中有明確要求，或實(shí)驗室能夠證明菌株相關(guān)特性沒(méi)有改變。若在傳代過(guò)程中出現明顯變異，也不可繼續使用。
二、菌種保存的基本原理
使微生物的生命活動(dòng)處于半永久性的休眠狀態(tài)，也就是使微生物的新陳代謝作用限制在最低范圍內。干燥、低溫和隔絕空氣是保證獲得這種狀態(tài)的主要措施。有針對性地創(chuàng )造干燥、低溫和隔絕空氣的外界條件，就是微生物菌種保藏的基本技術(shù)。
三、菌種保存的常用方法
（1）斜面保存法
操作方法：將營(yíng)養瓊脂（或其他適宜的瓊脂培養基）加熱煮沸溶解后分裝至試管中，滅菌后擺長(cháng)斜面凝固，挑取菌落“之”字形劃線(xiàn)接種至培養基斜面，置于合適的條件中進(jìn)行培養。培養結束后，置2-8℃冷藏保存（部分菌株會(huì )在4℃產(chǎn)生自溶，如銅綠假單胞菌。副溶血性弧菌等，可置室溫保存）。
此法為實(shí)驗室和工廠(chǎng)菌種室常用的保藏法，操作簡(jiǎn)單，使用方便，但易變異，屢次傳代會(huì )使微生物的代謝改變，而影響微生物的性狀，污染雜菌的機會(huì )亦較多。霉菌、酵母菌、放線(xiàn)菌和芽孢菌一般保存2-4個(gè)月傳代一次，細菌一般保存一個(gè)月傳代一次。
斜面保存法
（2）液體石蠟保存法
操作方法：將營(yíng)養瓊脂（或其他適宜的瓊脂培養基）加熱煮沸溶解，分裝至試管中滅菌后擺長(cháng)斜面，或使用半固體培養基加熱煮沸溶解后分裝至小試管，滅菌后擺直立，挑取菌落“之”字形劃線(xiàn)接種至培養基斜面或穿刺接種至半固體培養基管，置于合適的條件中進(jìn)行培養。培養結束后，在培養基表面覆蓋一層無(wú)菌液體石蠟，2-8℃冷藏保存。
液體石蠟一方面可防止因培養基水分蒸發(fā)而引起菌種死亡，另一方面可阻止氧氣進(jìn)入，以減弱代謝作用。此法比斜面保存法的保存期限更長(cháng)，霉菌、酵母菌、放線(xiàn)菌、芽孢菌可保存1-2年甚至更長(cháng)時(shí)間，多數無(wú)芽孢菌也可保存到一年以上。
（3）甘油凍存保存法
操作方法：挑取菌落至液體菌種保存管中（商品化的液體菌種保存管中已加入甘油，直接使用即可；若自行配制，可在凍存液中加入15%-50%比例的甘油，或將菌液與無(wú)菌甘油溶液混合），用移液槍吹打均勻，制成約109CFU/mL的菌懸液，置于超低溫冰箱中或液氮罐中冷凍保存（霉菌可挑取孢子凍存，保存溫度越低效果越好，長(cháng)期保存建議在-70℃以下凍存）。
該方法適用范圍廣，操作簡(jiǎn)便，效果好，無(wú)變異現象發(fā)生。-20℃保存時(shí)間較短，一般可保存一年左右，-70℃以下可保存較長(cháng)時(shí)間，一般至少可保存兩年以上，有些菌種甚至可保存十年以上。
注意事項：反復凍融易導致菌株死亡，在中國藥典中規定，融化后的菌種保存管不可再進(jìn)行冷凍保存。
液體菌種保存管（含甘油）
（4）真空冷凍干燥保存法
通常以牛奶為載體，加入菌株制成菌懸液，使用真空凍干機器進(jìn)行脫水凍干處理，制成凍干粉。相比較于其他保存方法，真空冷凍保存法更容易保存菌種的活力，延長(cháng)保存時(shí)間，適用于98%以上菌種的保存，但操作復雜，一般實(shí)驗室難以使用。
（5）載體保存法
以沙土、濾紙、硅膠等材料做為載體吸附菌株，通過(guò)五氧化二磷干燥保藏的方法。保藏時(shí)間長(cháng)，應用較為廣泛，但一般實(shí)驗室通常不易操作。
（6）瓷珠保存法
瓷珠菌種保存管是實(shí)驗室保存菌種的容器，管內有表面凹孔小瓷珠用于細菌的吸附和保存，甘油做為抗凍保護劑可減少冷凍過(guò)程中形成的冰晶，瓷珠菌種保存管放置于-20℃或-80℃下便可創(chuàng )造干燥、低溫、缺營(yíng)養的環(huán)境，使菌株處于“休眠” 狀態(tài)，方可長(cháng)期保存（視不同菌種與保存溫度，一般可保存3-10 年），同時(shí)菌種保存管的取用和保存較為便利（取用復蘇及保存菌株僅需1 分鐘）。
保存方法：挑取平板或斜面上的新鮮純培養物于菌種保存管中，配成大約3-4麥氏比濁度的菌懸液，蓋上蓋子來(lái)回顛倒幾次使細菌乳化，用無(wú)菌移液器將菌種保存管內的液體吸取干凈，僅留下瓷珠，擰緊保存管，迅速將其置于-20℃或-70℃冰箱中。
使用方法：無(wú)菌條件下，用滅過(guò)菌的針或者鑷子取出一個(gè)小瓷珠，將小瓷珠直接用作平板劃線(xiàn)或加到合適的液體培養基中，置合適的條件下進(jìn)行培養即可。
瓷珠菌種保存管
四、實(shí)驗室常用菌種的保存方法
（1）短期、中期保存：葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、埃希氏菌、志賀氏菌、假單胞菌、假單胞菌、李斯特氏菌等，可使用營(yíng)養瓊脂斜面或TSA斜面4℃保存（銅綠假單胞菌在4℃會(huì )出現自溶，可以置室溫保存），通�？杀４�1-3個(gè)月。白色念珠菌、酵母菌、霉菌等可使用沙氏葡萄糖瓊脂斜面4℃保存，通�？杀４�3-6個(gè)月。生孢梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌可使用皰肉培養基培養后置4℃保存，可存活數月至1年以上。
（2）長(cháng)期保存：對于大多數的細菌、真菌，普通實(shí)驗室都可以選用瓷珠保存法或甘油保存法置-20℃以下或-70℃以下凍存，溫度越低保存時(shí)間越長(cháng)。（注：保存霉菌時(shí)挑取孢子凍存即可；保存厭氧菌建議使用甘油保存法，避免反復凍融；使用甘油凍存法保存彎曲桿菌、螺桿菌、嗜血桿菌等細菌時(shí)，加入5%-10%比例的脫纖維羊血效果更佳）。
注:本文屬海博生物原創(chuàng ),未經(jīng)允許不得轉載。
上一篇：培養基保存的注意事項
下一篇：微生物盲樣檢測介紹及注意事項
海博微信公眾號
海博天貓旗艦店
