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一、制定方案
當我們獲得一株菌，在進(jìn)行復蘇活化之前，首先要了解菌株的生長(cháng)特性，確定菌株的營(yíng)養需求、生長(cháng)溫度、氣體環(huán)境、滲透壓、酸堿度及嗜鹽性等條件，選擇合適的培養基和培養環(huán)境，制定復蘇活化方案。通常從菌種保藏中心購買(mǎi)的菌株都附帶說(shuō)明書(shū)，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作即可。若沒(méi)有說(shuō)明書(shū)，可通過(guò)查閱文獻（推薦查看伯杰細菌手冊或常見(jiàn)細菌鑒定手冊）等方式確認菌株的生長(cháng)條件，再制定方案。
二、菌株處理及接種操作
獲得菌株后，原則上應盡早進(jìn)行活化和保存。若不能立即活化，應按照說(shuō)明書(shū)放入相應的環(huán)境中進(jìn)行保存。
（1）若保存的菌株為凍干粉形式或載體保存形式，可加入少量生理鹽水或非選擇性肉湯培養基進(jìn)行溶解懸浮，用劃線(xiàn)或涂布方式接種至平板，或吸取菌液至液體培養基中進(jìn)行培養。
（2）若保存的菌株為甘油凍存或液體保存形式，可在室溫速融后劃線(xiàn)或涂布接種至平板，或直接加入到液體培養基中進(jìn)行培養。
（3）若保存的菌株為瓷珠形式，可以挑取單個(gè)瓷珠在平板上滾動(dòng)數次或直接加入到液體培養基中進(jìn)行培養。
（4）若保存的菌株為斜面或半固體形式，可直接挑取菌苔轉接至平板或液體培養基中進(jìn)行培養。
三、培養基的選擇
活化菌株使用的培養基的成分通常包括以下幾個(gè)組分：（1）基本營(yíng)養成分，如蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉等，主要提供碳源、氮源及微量元素等；（2）氯化鈉：維持一定的滲透壓環(huán)境；（3）磷酸鹽：維持pH的相對穩定；（4）特殊成分：如血清、半胱氨酸、氯化血紅素等，促進(jìn)特定菌的生長(cháng)。根據菌株的生長(cháng)特性，選擇合適的培養基或對特定的培養基添加成分進(jìn)行改良，以滿(mǎn)足菌株的生長(cháng)需求，常用活化培養基有以下幾種：
（1）胰酪大豆胨液體/瓊脂培養基、營(yíng)養肉湯/瓊脂培養基、腦心浸液肉湯/瓊脂培養基：營(yíng)養豐富，適用于多數常見(jiàn)細菌的復蘇活化培養。
注：可在培養基中加入血液、血清、維生素、氯化血紅素等成分增加營(yíng)養，培養一些營(yíng)養苛求的細菌。
（2）血平板：可使用血液瓊脂基礎加入5%-10%的脫纖維羊血或兔血，也可使用TSA或BHI等培養基做為基礎加入5%-10%的脫纖維羊血或兔血制成血平板，可以培養一些營(yíng)養要求較高的細菌，如彎曲菌、嗜血桿菌、奈瑟氏菌、梭菌、鏈球菌、螺桿菌等。
（3）巧克力平板：與血平板不同的是，利用輕微加熱使血液中的紅細胞裂解釋放出內部各種生長(cháng)因子，制成的平板呈巧克力色，該培養基常用于嗜血桿菌、奈瑟氏菌、鏈球菌的培養。
（4）MRS肉湯/瓊脂：偏酸的pH和較高的糖含量，適合乳酸菌的生長(cháng)，常用于乳桿菌、乳球菌、雙歧桿菌等乳酸菌的培養。
（5）2216E液體/瓊脂培養基：與海水相似的成分和滲透壓，常用于海生細菌的培養，如副溶血性弧菌、溶藻弧菌、哈氏弧菌等，在含3%左右鹽度的培養基中生長(cháng)旺盛。
（6）皰肉培養基、硫乙醇酸鹽流體培養基：常用于厭氧梭菌的培養，如產(chǎn)氣莢膜梭菌、生孢梭菌等。
注：使用液體培養基培養厭氧菌時(shí)，在培養基表面覆蓋液體石蠟隔絕空氣，無(wú)需放入厭氧培養箱中，可直接培養厭氧菌（硫乙醇酸鹽流體培養基可自然形成厭氧環(huán)境，無(wú)需覆蓋液體石蠟，也無(wú)需厭氧培養）。
（7）BCYE：專(zhuān)用于軍團菌的培養。
（8）沙氏葡萄糖液體/瓊脂培養基：較高的糖含量有利于真菌的生長(cháng)，常用來(lái)培養霉菌、酵母菌等真菌。
（9）支原體肉湯、精氨酸支原體肉湯：需加入血清，用于培養肺炎支原體、口腔支原體等。
（10）ISP2、高氏1號培養基：常用于放線(xiàn)菌的培養。
（11）GAM培養基：該培養基營(yíng)養較高，可用于多種需氧厭氧菌的培養，如擬桿菌、梭菌、雙歧桿菌等。
（12）羅氏培養基、Middle Brook 7H10：用于分枝桿菌的培養。
注：活化菌株時(shí)，通常不宜使用帶有抑菌作用的選擇性培養基，如金黃色葡萄球菌活化可使用TSA/TSB，但通常不宜使用甘露醇氯化鈉瓊脂、Baird-parker瓊脂等選擇性平板進(jìn)行活化。
四、培養條件
（1）溫度：大多數細菌最適生長(cháng)溫度在30-37℃，真菌和放線(xiàn)菌最適生長(cháng)溫度在20-30℃，彎曲菌最適生長(cháng)溫度為42℃，嗜熱菌最適生長(cháng)溫度在55℃左右或更高，嗜冷菌通常在20℃以下生長(cháng)。
（2）氣體環(huán)境
專(zhuān)性需氧型：如銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌等，需要有氧氣才能生長(cháng)，在正常的空氣中培養即可。
兼性厭氧型：如大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等，有氧無(wú)氧均可生長(cháng)良好，在正常的空氣中培養即可。
專(zhuān)性厭氧型：如雙歧桿菌、梭菌、擬桿菌等，氧氣對這些細菌會(huì )產(chǎn)生毒害作用，抑制生長(cháng)，因此需在專(zhuān)用的厭氧培養箱或厭氧罐中進(jìn)行培養。多數厭氧菌需5%的二氧化碳促進(jìn)生長(cháng)。
微需氧型：如彎曲菌、螺桿菌等，適合在5%-10%氧氣的環(huán)境中生長(cháng)，需在微需氧培養箱或培養罐中進(jìn)行培養。
二氧化碳：一些細菌的初次培養或分離需要二氧化碳環(huán)境促進(jìn)生長(cháng)，如肺炎鏈球菌、軍團菌等。
（3）其他條件：如光合細菌需要光照等。
五、常見(jiàn)細菌的推薦活化培養方式
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菌株名稱(chēng) |
活化培養方式 |
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大腸埃希氏菌、沙門(mén)氏菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌、志賀氏菌、變形桿菌、阪崎腸桿菌、李斯特氏菌、克雷伯氏菌、沙雷氏菌、腸球菌、嗜水氣單胞菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、洋蔥伯克霍爾德氏菌等 |
TSA/TSB或NA/NB，30-36℃培養18-24h |
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白色念珠菌、釀酒酵母等 |
SDA/SDB/PDA，20-25℃培養3-5天 |
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黑曲霉 |
SDA/PDA，20-25℃培養5-7天或培養至產(chǎn)黑色孢子 |
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白色鏈霉菌 |
ISP2培養基28-30℃培養3-5天 |
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產(chǎn)氣莢膜梭菌、生孢梭菌、艱難梭菌 |
硫乙醇酸鹽流體培養基或皰肉培養基30-36℃培養24-48h，或血平板、哥倫比亞平板30-36℃厭氧培養24-48h。 注：梭菌在硫乙醇酸鹽流體培養基中存活時(shí)間較短，可使用皰肉培養基保存較長(cháng)時(shí)間。 |
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植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌嬰兒雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌等 |
MRS瓊脂/肉湯36±1℃培養24-48h（雙歧桿菌需厭氧培養） |
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副溶血性弧菌、創(chuàng )傷弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌等 |
2216E液體/瓊脂培養基或3%氯化鈉TSA，30-36℃培養18-24h |
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肺炎鏈球菌、溶血性鏈球菌 |
血平板36±1℃培養24-48h |
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藤黃微球菌 |
TSA或營(yíng)養瓊脂30-36℃培養24-48h |
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空腸彎曲菌、結腸彎曲菌等 |
血平板42℃微需氧培養24-48h |
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腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血桿菌等 |
血平板或巧克力平板，36±1℃培養24-72h，奈瑟菌初次分離通常需5%-10%二氧化碳環(huán)境 |
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脆弱擬桿菌 |
血平、GAM或BBE36±1℃厭氧培養24-48h |
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口腔支原體、肺炎支原體 |
精氨酸支原體肉湯（口腔）或支原體肉湯（肺炎）36±1℃培養3-7天，初代復活通常比較難培養，有時(shí)需數周時(shí)間，中間還需進(jìn)行盲傳2次，在含5%-10%的二氧化碳環(huán)境更易培養 |
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博茲曼軍團菌、嗜肺軍團菌等 |
BCYE36±1℃培養3-7天，初代培養在5%二氧化碳環(huán)境中生長(cháng)更好 |
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