常見(jiàn)食源性致病菌的革蘭氏染色觀(guān)察

一、革蘭氏染色液成分及原理

  革蘭氏染色法是細菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法。未經(jīng)染色之細菌，由于其與周?chē)�環(huán)境折光率差別甚小，故在顯微鏡下極難觀(guān)察。染色后細菌與環(huán)境形成鮮明對比，可以清楚地觀(guān)察到細菌的形態(tài)、排列及某些結構特征，而用以分類(lèi)鑒定。

  革蘭氏陽(yáng)性菌的細胞壁主要有90%的肽聚糖和10%的磷壁酸組成，幾乎不含類(lèi)脂質(zhì)，厚度20-80nm。革蘭氏陰性菌的細胞壁主要由肽聚糖、脂多糖構成，厚度約10-15nm。結晶紫初染和碘液媒染后，在菌體內形成了不溶于水的大分子復合物，在使用乙醇脫色時(shí)，革蘭氏陽(yáng)性菌由于其細胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，失水網(wǎng)孔縮小，把結晶紫與碘復合物牢牢留在壁內，使其仍呈紫色；革蘭氏陰性菌其細胞壁薄、外膜層類(lèi)脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類(lèi)脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結晶紫與碘復合物的溶出，因此通過(guò)乙醇脫色后仍呈無(wú)色，再經(jīng)沙黃等紅色染料復染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。

二、操作步驟

  1.涂片：在載玻片上滴少量純化水，用接種環(huán)挑取少量菌苔涂開(kāi)，自然干燥或微熱干燥，再經(jīng)火焰2-3次固定。

  2.初染：加（結晶紫溶液）溶液A染1分鐘，用清水沖去染液。

  3.媒染：加（碘液）溶液B染1分鐘，水洗。

  4.脫色：加（95%乙醇）溶液C，不時(shí)搖動(dòng)玻片約10-30秒，至無(wú)紫色脫落為止，水洗。

  5.復染：加（沙黃復染液）溶液D，染1分鐘，水洗。

  6.觀(guān)察：用濾紙吸水晾干后油鏡鏡檢。陽(yáng)性菌呈紫色、陰性菌呈紅色。

三、注意事項

  （1）涂片時(shí)挑取菌量不宜過(guò)多，涂片不宜過(guò)厚，否則可能導致染色不完全或脫色不完全。

  （2）脫色是革蘭氏染色操作中至關(guān)重要的一步，脫色時(shí)間要把握準確。脫色過(guò)度易導致革蘭氏陽(yáng)性菌染成紅色，脫色不足易導致革蘭氏陰性菌染成紫色。

  （3）革蘭氏染色宜選用細菌新鮮培養物。一些革蘭氏陽(yáng)性菌在培養時(shí)間過(guò)長(cháng)后易出現老化現象，細胞壁發(fā)生改變，導致染色結果發(fā)生變化。

  （4）并不是所有革蘭氏陽(yáng)性菌都會(huì )染成紫色，革蘭氏陰性菌都會(huì )染成紅色。一些細菌的細胞壁構成比較特殊或易發(fā)生改變，染色時(shí)會(huì )觀(guān)察到相反的結果。

四、染色結果觀(guān)察

  （1）大腸埃希氏菌O157和普通大腸埃希氏菌、沙門(mén)氏菌為革蘭氏陰菌，鏡檢形態(tài)為紅色短桿菌。

大腸埃希氏菌O157:H7 ATCC35150	大腸埃希氏菌ATCC25922	鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028

  （2）志賀氏菌為革蘭氏陰性短桿菌

福氏志賀氏菌ATCC12022	宋內志賀氏菌ATCC25931	痢疾志賀氏菌CMCC51252

  （3）產(chǎn)氣莢膜梭菌為革蘭氏陽(yáng)性梭桿菌，有時(shí)可見(jiàn)菌體內膨大不著(zhù)色的芽孢結構；單增李斯特氏菌為革蘭氏陽(yáng)性無(wú)芽孢短桿菌；蠟樣芽胞桿菌為革蘭氏陽(yáng)性芽孢長(cháng)桿菌，常呈鏈狀排列，菌體內或外有時(shí)可見(jiàn)不著(zhù)色的橢圓形芽孢。

產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124	單增李斯特氏菌ATCC19114	蠟樣芽胞桿菌ATCC11778

金黃色葡萄球菌ATCC25923	副溶血性弧菌ATCC17802	唐菖蒲伯克霍爾德氏菌CICC10574

普通變形桿菌CMCC49027	奇異變形桿菌CMCC49005	小腸結腸炎耶爾森氏菌CMCC52204

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