一、標準
《GB4789.36-2016 食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗》第一法：常規培養法
二、大腸埃希氏菌O157:H7/NM簡(jiǎn)介
大腸埃希氏菌是動(dòng)物腸道中正常菌群之一，極少數可引起人類(lèi)疾病，具有致病性的大腸埃希氏菌主要由六種致瀉大腸埃希氏菌（DEC）組成：腸道致病性大腸埃希氏菌（EPEC）、腸道侵襲性大腸埃希氏菌（EIEC）、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌（ETEC）、產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌（STEC）、腸道出血性大腸埃希氏菌（EHEC）、腸道集聚性大腸埃希氏菌（EAEC）。大腸埃希氏菌O157屬于腸道出血性大腸埃希氏菌（EHEC），O157:H7為常見(jiàn)血清型代表菌株，O157:NM為無(wú)動(dòng)力菌株。
三、檢驗流程
3.1 增菌
以無(wú)菌操作取檢樣25g(或25mL)加入到含有225mL mEC+n肉湯的均質(zhì)袋中,在拍擊式均質(zhì)器上連續均質(zhì)1 min~2 min；或放入盛有225 mL mEC+n肉湯的均質(zhì)杯中,8000r/min~10000r/min均質(zhì)1min~2min。 36 ℃±1℃培養18h~24h。
3.2 分離
取增菌后的mEC+n肉湯，劃線(xiàn)接種于CT-SMAC平板和大腸埃希氏菌O157顯色瓊脂平板上，36℃±1℃培養18h~24h，觀(guān)察菌落形態(tài)。
（1）改良山梨醇麥康凱瓊脂（CT-SMAC）
大腸埃希氏菌O157通常不發(fā)酵或遲緩發(fā)酵山梨醇，而大腸埃希氏菌則可以發(fā)酵山梨醇產(chǎn)酸，因此常用山梨醇麥康凱瓊脂或改良山梨醇麥康凱瓊脂分離大腸埃希氏菌O157。大腸埃希氏菌O157在CT-SMAC平板上由于不能分解山梨醇產(chǎn)酸，通常為圓形無(wú)色菌落，中心顯灰褐色，而能發(fā)酵山梨醇產(chǎn)酸的大腸埃希氏菌、沙門(mén)氏菌等在CT-SMAC上菌落顯粉紅色或桃紅色，菌落周?chē)袝r(shí)可見(jiàn)沉淀環(huán)。
CT-SMAC平板上的大腸埃希氏菌O157（左）和普通大腸埃希氏菌（右）
（2）O157菌顯色培養基
O157菌顯色培養基利用特異性酶底物法原理，大腸埃希氏菌O157在顯色培養基上呈亮紅色菌落，而大腸埃希氏菌、沙門(mén)氏菌、大腸菌群等在顯色培養基上呈藍色。
O157菌顯色培養基——大腸埃希氏菌O157（左）、大腸埃希氏菌（右）
3.3 初步生化試驗
在CT-SMAC和大腸埃希氏菌O157顯色瓊脂平板上分別挑取5個(gè)~10個(gè)可疑菌落，分別接種TSI瓊脂，同時(shí)接種 MUG-LST 肉湯，并用大腸埃希氏菌株(ATCC25922或等效標準菌株)做陽(yáng)性對照和大腸埃希氏菌O157：H7(NCTC12900或等效標準菌株)做陰性對照，于36℃±1℃培養18h~24h。必要時(shí)進(jìn)行氧化酶試驗和革蘭氏染色。
注：挑取可疑菌落接種三糖鐵瓊脂和LST-MUG后，可同時(shí)劃線(xiàn)至營(yíng)養瓊脂平板，以備后續做血清學(xué)試驗和生化試驗使用。
（1）三糖鐵瓊脂（TSI）試驗
挑取可疑菌落在三糖鐵斜面“之”字形劃線(xiàn)并穿刺接種后，置于36±1℃培養18-24h。大腸埃希氏菌O157與大腸埃希氏菌在三糖鐵瓊脂上反應相同，均可發(fā)酵乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不產(chǎn)硫化氫，現象為斜面和底層均為黃色（A/A），底層無(wú)黑色出現（H2S陰性），瓊脂可見(jiàn)斷層（產(chǎn)氣）。若斜面出現紅色（K/A或K/K），或底層出現黑色（H2S陽(yáng)性），均可排除大腸埃希氏菌O157。
TSI試驗現象
TSI使用注意事項：（1）配制時(shí)需加熱煮沸至瓊脂完全溶解，分裝至試管。若瓊脂未完全溶解就進(jìn)行分裝，易出現滅菌后培養基不凝固問(wèn)題；（2）培養過(guò)程中斜面需要與空氣中的氧氣發(fā)生反應，因此必須使用透氣性良好的試管塞或半開(kāi)蓋培養，不可密閉培養。
（2）LST-MUG熒光試驗
挑取可疑菌落接種至LST-MUG培養基中（需同時(shí)接種MUG陽(yáng)性的大腸埃希氏菌和MUG陰性的大腸埃希氏菌O157做對照），置于36±1℃培養18-24h。培養結束后，在黑暗中使用365nm波長(cháng)紫外燈照射，觀(guān)察有無(wú)熒光。大腸埃希氏菌O157不能分解MUG產(chǎn)熒光，而大腸埃希氏菌可分解MUG產(chǎn)熒光。
MUG試驗（左為大腸埃希氏菌有熒光，右為大腸埃希氏菌O157無(wú)熒光）
注：在標準附錄A培養基的配制方法中，要求配制LST-MUG需使用帶小倒管的試管，但在檢驗過(guò)程中卻并未要求觀(guān)察是否產(chǎn)氣。大腸埃希氏菌O157和大腸埃希氏菌都是可以發(fā)酵乳糖產(chǎn)氣的，因此在試驗中還可以看到小倒管中有氣體產(chǎn)生（標準未提及）。
（3）革蘭氏染色
大腸埃希氏菌O157為革蘭氏陰性桿菌（紅色桿菌）。
（4）氧化酶試驗
紙片法：使用少量無(wú)菌生理鹽水潤濕氧化酶試紙，用塑料接種環(huán)挑取可疑菌落涂抹至氧化酶試紙，陽(yáng)性結果通常在30秒內出現深藍色（若使用的氧化酶試劑為N,N'-二甲基對苯二胺鹽酸鹽，陽(yáng)性結果為紫紅色），2分鐘內不變色即為氧化酶陰性。大腸埃希氏菌O157氧化酶試驗為陰性，不出現深藍色。
氧化酶試驗（左為大腸埃希氏菌O157陰性，右為銅綠假單胞菌陽(yáng)性）
注意事項：挑取菌落時(shí)應使用塑料接種環(huán)，玻璃棒或鉑金接種環(huán)，不可使用鐵制品，否則可能出現假陽(yáng)性反應。
3.4 鑒定
（1）血清學(xué)試驗
在營(yíng)養瓊脂平板上挑取分離純化的菌落，用O157和H7診斷血清或 O157乳膠凝集試劑作玻片凝集試驗。對于H7因子血清不凝集者，應穿刺接種半固體瓊脂，檢查動(dòng)力，經(jīng)連續傳代3次，動(dòng)力試驗均陰性，確定為無(wú)動(dòng)力株。
注：需同時(shí)使用O157血清和H7血清做凝集試驗，若均凝集，則為大腸埃希氏菌O157:H7菌株；若O157血清凝集而H7血清不凝集，需穿刺接種半固體瓊脂檢查動(dòng)力，若連續傳代3次動(dòng)力試驗均為陰性，則為大腸埃希氏菌O157:NM菌株；若傳代過(guò)程出現動(dòng)力陽(yáng)性，可再次使用H7血清做凝集試驗，檢查是否為O157:H7菌株。
（2）生化試驗
大腸埃希氏菌O157生化反應結果：靛基質(zhì)陽(yáng)性，山梨醇發(fā)酵為陰性或遲緩陽(yáng)性，甲基紅（MR）陽(yáng)性，V-P陰性，賴(lài)氨酸脫羧酶陽(yáng)性，鳥(niǎo)氨酸脫羧酶陽(yáng)性，西蒙氏檸檬酸鹽陰性，纖維二糖陰性，棉子糖陽(yáng)性，O157:H7菌株動(dòng)力陽(yáng)性，O157:NM菌株動(dòng)力陰性。
注：1.靛基質(zhì)、甲基紅、VP試驗均需培養結束后滴加相應試劑觀(guān)察結果，靛基質(zhì)和甲基紅試驗滴加試劑后應立即觀(guān)察結果，VP試驗滴加試劑后應繼續培養0.5-4h觀(guān)察結果；2.賴(lài)氨酸脫羧酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶試驗需同時(shí)做氨基酸脫羧酶對照管，接種后并覆蓋無(wú)菌液體石蠟，當對照管變黃，試驗管變紫時(shí)為氨基酸脫羧酶陽(yáng)性反應，若對照管與試驗管均為黃色，則為氨基酸脫羧酶陰性反應，若對照管未變黃色，可能試驗菌為非發(fā)酵型細菌，不能直接判斷氨基酸脫羧酶反應的陰陽(yáng)性（O157菌為發(fā)酵菌，對照管必變黃）；3.山梨醇遲緩發(fā)酵型細菌，培養24h內通常觀(guān)察不到陽(yáng)性結果，需延長(cháng)培養2-7天后可見(jiàn)陽(yáng)性結果。
大腸埃希氏菌O157:H7生化鑒定結果
3.5 毒力基因測定（選做）
樣品中檢出大腸埃希氏菌 O157:H7或 O157:NM 時(shí)，如需要進(jìn)一步檢測 Vero細胞毒素基因的存在，可通過(guò)接種 Vero細胞或 HeLa細胞，觀(guān)察細胞病變進(jìn)行判定；也可使用基因探針檢測或聚合酶鏈反應(PCR)方法進(jìn)行志賀毒素基因(stx1、stx2)、eae、hly 等基因的檢測。
3.6 結果報告
綜合生化和血清學(xué)試驗結果，報告25g(或25mL)樣品中檢出或未檢出大腸埃希氏菌 O157:H7或大腸埃希氏菌 O157:NM。
注：出具結果報告時(shí)，要寫(xiě)明檢出的O157菌的具體血清型是H7或NM。
注：本文屬海博生物原創(chuàng )，未經(jīng)允許不得轉載。
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