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一、參考標準
《GB5009.211-2014食品安全國家標準 食品中葉酸的測定》
二、方法原理
葉酸是鼠李糖乳桿菌Lactobacillus casei spp.rhamnosus（ATCC7469）生長(cháng)所需的營(yíng)養素，在一定控制條件下，將鼠李糖乳桿菌液接種至含有式樣液的培養液中，培養一段時(shí)間后測定透光率（或吸光度值），根據葉酸含量與透光率（或吸光度值）的標準曲線(xiàn)計算出試樣中葉酸的含量。
三、試驗用品及預處理
（1）培養基：葉酸測定用培養基。
（2）磷酸鹽緩沖液（0.05mol/L，PH6.8）、氫氧化鈉乙醇溶液（0.01mol/L）、雞胰腺溶液、蛋白酶-淀粉酶液純化水等。
（3）容器：試管、移液管、容量瓶、量筒、玻璃棒、錐形瓶。
注意事項：
1.本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規定的二級水。水的潔凈程度對本試驗至關(guān)重要，若水中有葉酸殘留或接觸了有葉酸殘留的容器，將直接影響到試驗結果；
2.試驗中使用的玻璃器具需洗凈后在200℃烘至少2h，必要時(shí)可預先用1mol/L的稀鹽酸浸泡再烘，充分去除容器中可能殘留的葉酸；
3.使用的葉酸測定培養基需確保不含有葉酸，其他營(yíng)養齊全。若自行配制培養基，需確保原材料中不含有葉酸，制備過(guò)程不可污染葉酸。
四、標準溶液的制備
（1）葉酸標準貯備液（20.0 μg /mL）：精確稱(chēng)取20.0mg葉酸標準品，用氫氧化鈉乙醇溶液溶解轉移至1000mL棕色容量瓶中，定容至刻度。
（2）葉酸中間液（0.200ug/mL）：用氫氧化鈉乙醇溶解將1.0mL葉酸貯備液定容至100mL棕色容量瓶。
（3）葉酸標準工作液（0.200 ng/mL）：用水將1.0mL葉酸中間液定容至1000mL容量瓶。
注意事項：
1.標準溶液配制過(guò)程中使用的溶劑、容器必須確保無(wú)葉酸殘留；
2.葉酸貯備液存于棕色瓶中，于2℃-4℃冰箱可保存2年，中間液可保存1年，標準工作液臨用前配制。
四、菌株活化及菌懸液制備
（1）將鼠李糖乳桿菌（ATCC 7469）轉接至瓊脂培養基中，在37℃±1℃培養箱中培養20h-24h，連續傳中2代-3代。
（2）實(shí)驗前一天，取2mL葉酸標準工作液與4mL葉酸測定用培養液混勻，分裝至2支5mL離心管中，于121℃高壓滅菌 15 min 即為種子培養液。待冷卻后用接種環(huán)將活化的菌株轉種至2支種子培養液中，于37℃±1℃培養箱培養20h-24h。將種子培養液混勻，無(wú)菌操作下吸取0.5mL轉種至另2支已消毒但不含葉酸的培養液中，37℃±1℃培養6h，振蕩混勻，制成接種液，立即使用。
注意事項：制備菌株過(guò)程需注意嚴格進(jìn)行無(wú)菌操作，防止污染雜菌。
五、樣品處理
（1）直接提取法：稱(chēng)取固體試樣或液體試樣0.5g-2g（精確到0.001g），轉入100mL錐形瓶中，加入80mL氫氧化鈉乙醇溶液，超聲振蕩2h-4h至試樣完全溶解或分散，用水定容至刻度。
（2）酶解提取法：稱(chēng)取適量試樣（精確到0.001g），轉至100mL錐形瓶中，加入30mL磷酸緩沖液，振搖5min后，于121℃高壓水解15min；待試樣冷卻至室溫，加入1mL雞胰腺溶液（含有蛋白質(zhì)、淀粉的試樣需另加入1mL蛋白酶-淀粉酶液）混合，加入3滴-5滴甲苯后，置于37℃±1℃培養箱內酶解16h-20h，取出轉入100mL容量瓶，加水定容至刻度，過(guò)濾。
注意事項：
1.形態(tài)為顆粒、粉末、片劑、液體的營(yíng)養補充劑或強化劑、預混料；以飲料為基質(zhì)或葉酸添加量＞100ug/100g的食品可采用直接提取法；
2.以谷物、乳粉等為基質(zhì)的配方食品如需計量基質(zhì)本底葉酸含量，可采取酶提取法。
六、試驗步驟
（1）標準曲線(xiàn)制作：按下表順序加入水、標準曲線(xiàn)工作液和葉酸測定用培養基于試管中，做3個(gè)平行組。
|
試管 |
S1 |
S2 |
S3 |
S4 |
S5 |
S6 |
S7 |
S8 |
S9 |
S10 |
|
水（mL） |
5 |
4.75 |
4.5 |
4 |
3.5 |
3 |
2.5 |
2 |
1 |
0 |
|
0.200ng/mL標準曲線(xiàn)工作液（mL） |
0 |
0.25 |
0.50 |
1.00 |
1.50 |
2.00 |
2.50 |
3.00 |
4.00 |
5.00 |
|
培養基（mL） |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
注意事項：準備標準系列管時(shí)另準備一支標準0管（含0.00ng葉酸）不接種作為0對照管。
（2）試樣和酶空白系列管的制作：按下表順序加入水、試樣稀釋液和葉酸培養基于試管中，做3個(gè)平行組。
|
試管 |
1 |
2 |
3 |
|
水（mL） |
4.5 |
4 |
3 |
|
待測液（mL） |
0.5 |
1.0 |
2.0 |
|
培養基（mL） |
5 |
5 |
5 |
（3）滅菌：將所有試管置于121℃滅菌15min，滅菌結束后，迅速冷卻至30℃以下。
注意事項：不可滅菌時(shí)間過(guò)長(cháng)或長(cháng)時(shí)間在滅菌鍋中保溫，防止培養基中維生素成分過(guò)量降解；滅菌后的培養基宜當天使用。
（4）接種：用滴管或移液器向上述試管中各滴加1滴（約20μL）測試菌液（其中標準曲線(xiàn)管中空白0對照管除外）。
（5）培養：將試管放入恒溫培養箱內，37±1℃培養20h～24h。
（6）觀(guān)察：培養結束后，若0對照管有明顯的細菌增長(cháng)，或與0對照管相比，標準0管透光率在90%以下，或標準系列管透光率最大變化量＜40%，說(shuō)明可能有雜菌或不明來(lái)源葉酸混入，需重做實(shí)驗。
（7）測定：將培養好的標準系列管、試樣和酶空白系列管用漩渦混勻器混勻。用未接種0對照管調節透光率為100%（或吸光度值為0），依次測定標準系列管、試樣和酶空白系列管的透光率（或吸光度值）。
注意事項：
1.在進(jìn)行吸光度測定時(shí)，測量的OD值在0.2-0.8之間相對更準確，線(xiàn)性關(guān)系更好，若測得OD值超出范圍，可進(jìn)行倍數稀釋再進(jìn)行測定。
2.葉酸測定適宜的光譜范圍540nm-610nm。
（8）標準曲線(xiàn)制作及計算：以標準系列管葉酸含量為橫坐標，每個(gè)標準點(diǎn)透光率（或吸光度值）均值為縱坐標，繪制標準曲線(xiàn)。
試樣結果計算：從標準曲線(xiàn)查得試樣或酶空白系列管中葉酸的相應含量（Cx），如果3支試樣系列管中有2支葉酸含量在0.10ng-0.80ng范圍內，且各管之間折合為每毫升試樣提取液中葉酸含量的偏差小于10%，則可能繼續按式（2）、式（3）、式（4）進(jìn)行結果計算，否則需重新取樣測定。
試樣稀釋液葉酸濃度按式（2）計算：
采用酶解提取法的試樣葉酸含量按式（4）計算：
注意事項：
1.液體試樣葉酸含量也可以微克每百毫升（ug/100mL）為單位；
2.以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的算術(shù)平均值表示，結果保留三位有效數字。
七、實(shí)驗現象及標準曲線(xiàn)制作
（1）實(shí)驗現象：
（2）標準曲線(xiàn)制作：
八、試驗關(guān)鍵點(diǎn)總結
（1）試驗用使用的玻璃容器、水、培養基等必須確保無(wú)維生素B12殘留，整個(gè)試驗過(guò)程操作要注意不能污染葉酸，否則會(huì )導致標準曲線(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系差或做不出標準曲線(xiàn)；
（2）標準溶液制備過(guò)程中必須精確稱(chēng)量、定容，若配制的標準溶液誤差過(guò)大會(huì )直接影響最終測定結果；
（3）使用的鼠李糖乳桿菌要連續進(jìn)行傳代至活力旺盛，且無(wú)雜菌污染；在進(jìn)行菌體離心-懸浮清洗的重復操作時(shí)，需確保清洗干凈，不能有活化培養基殘留，殘留的培養基中可能含有葉酸，對試驗結果造成不良影響；
（4）進(jìn)行OD值測定時(shí)，盡可能保證測得吸光度范圍在0.2-0.8之間，若超出此范圍，可使用空白培養基進(jìn)行倍數稀釋后再進(jìn)行測定。
注：本文屬海博生物原創(chuàng )，未經(jīng)允許不得轉載。
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