大腸埃希氏菌計數方法

一、大腸埃希氏菌簡(jiǎn)介

  大腸埃希氏菌（Escherichia coli）又稱(chēng)大腸桿菌，廣泛存在于人和溫血動(dòng)物的腸道中，能夠在44.5℃發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，IMViC（靛基質(zhì)、甲基紅、VP試驗、檸檬酸鹽）生化試驗結果為＋＋－－或－＋－－的革蘭氏陰性桿菌。以此作為糞便污染指標來(lái)評價(jià)食品的衛生狀況，推斷食品中腸道致病菌污染的可能性。

二、參考標準

  《GB 4789.38-2012 食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 大腸埃希氏菌計數》。

三、檢驗流程

  （一）MPN法

圖1 大腸埃希氏菌MPN計數法檢驗程序

  1.初發(fā)酵試驗

  每個(gè)樣品，選擇3個(gè)適宜的連續稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個(gè)稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過(guò)1mL，則用雙料LST肉湯），36±1℃培養24±2h，觀(guān)察小倒管內是否有氣泡產(chǎn)生，24±2h產(chǎn)氣者進(jìn)行復發(fā)酵試驗，如未產(chǎn)氣則繼續培養48±2h。產(chǎn)氣者進(jìn)行復發(fā)酵試驗。如所有LST肉湯管均未產(chǎn)氣，即可報告大腸埃希氏菌MPN結果。

  根據標準菌株對月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯進(jìn)行驗證。大腸菌群、大腸桿菌和發(fā)酵乳糖的革蘭氏陰性細菌產(chǎn)生氣體，在小倒管內有氣泡；其它細菌無(wú)氣泡。結果如圖2所示：

a:鼠傷寒沙門(mén)氏菌 b:大腸埃希氏菌 c:弗氏檸檬酸桿菌 d:陰溝腸桿菌 e:糞腸球菌 f:空白對照

圖2 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯微生物質(zhì)控結果

  2.復發(fā)酵試驗

  用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養物1環(huán)，移種于已提前預溫至45℃的EC肉湯管中，放入帶蓋的44.5±0.2℃水浴箱內。水浴的水面應高于肉湯培養基液面，培養24±2h，檢查小倒管內是否有氣泡產(chǎn)生，如未有產(chǎn)氣則繼續培養至48±2h。記錄在24h和48h內產(chǎn)氣的EC肉湯管數。如所有EC肉湯管均未產(chǎn)氣，即可報告大腸埃希氏菌MPN結果；如有產(chǎn)氣者，則進(jìn)行EMB平板分離培養。

  根據標準菌株對EC肉湯進(jìn)行驗證。糞大腸菌群和大腸桿菌產(chǎn)生氣體，在倒立小發(fā)酵管中有氣泡。結果如圖3所示：

a:大腸埃希氏菌菌 b:鼠傷寒沙門(mén)氏菌 c:弗氏檸檬酸桿菌 d:陰溝腸桿菌 e:肺炎克雷伯氏菌 f:空白對照

圖3 EC肉湯微生物質(zhì)控結果

  3.伊紅美藍（EMB）平板分離培養

  輕輕振搖各產(chǎn)氣管，用接種環(huán)取培養物分別劃線(xiàn)接種于EMB平板，36±1℃培養18～24h。觀(guān)察平板上有無(wú)具黑色中心有光澤或無(wú)光澤的典型菌落。           

  根據標準菌株對EMB培養基進(jìn)行驗證。典型大腸埃希氏菌菌落特征為具黑色中心有金屬光澤，產(chǎn)氣腸桿菌為粉紅色菌落無(wú)光澤，鼠傷寒沙門(mén)氏菌為無(wú)色菌落。結果如圖4所示：

a:大腸埃希氏菌 b:產(chǎn)氣腸桿菌 c:鼠傷寒沙門(mén)氏菌

圖4 EMB培養基微生物質(zhì)控結果

  4.革蘭氏染色

  挑取營(yíng)養瓊脂培養基上的純培養的單個(gè)可疑菌落，進(jìn)行革蘭氏染色。大腸埃希氏菌為革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌，呈紅色桿狀。結果如圖5所示：

圖5 大腸埃希氏菌的革蘭氏染色結果

  5.生化鑒定

  取培養物進(jìn)行靛基質(zhì)試驗、甲基紅試驗、VP試驗和檸檬酸鹽利用試驗，可選取使用大腸桿菌生化鑒定條進(jìn)行生化鑒定，大腸埃希氏菌的生化反應結果為靛基質(zhì)陽(yáng)性、甲基紅陽(yáng)性、VP陰性、檸檬酸鹽陰性。如圖6所示：

圖6 大腸埃希氏菌生化鑒定條試驗結果

  6.結果判定

  大腸埃希氏菌為革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌，發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，IMViC生化試驗為＋＋--或-＋--。只要有1個(gè)菌落鑒定為大腸埃希氏菌，其所代表的LST肉湯管即為大腸埃希氏菌陽(yáng)性。依據LST肉湯陽(yáng)性管數查MPN表，報告每g（mL）樣品中大腸埃希氏菌MPN值。

  （二）平板計數法

圖7 大腸埃希氏菌平板計數法檢驗程序

  1.平板計數

  取2～3個(gè)適宜的連續稀釋度的樣品勻液，每個(gè)稀釋度接種2個(gè)無(wú)菌平皿， 每皿1mL。同時(shí)取1mL稀釋液加入無(wú)菌平皿做空白對照。

  將10～15 mL 冷至45±0.5℃的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）傾注于每個(gè)平皿中。小心旋轉平皿，將培養基與樣品勻液充分混勻。待瓊脂凝固后，再加3～4 mL VRBA-MUG覆蓋平板表層。凝固后翻轉平板，36±1℃培養18～24 h。

  根據標準菌株對VRBA培養基進(jìn)行驗證，大腸埃希氏菌為紫紅色菌落，有膽鹽沉淀環(huán)；在紫外燈照射下有熒光。結果如圖8所示：

a;大腸埃希氏菌 b;弗氏檸檬酸桿菌 c;陰溝腸桿菌

圖8 VRBA培養基微生物質(zhì)控結果

  注意事項：選擇菌落數在10～100CFU之間的平板，暗室中360～366nm波長(cháng)紫外燈照射下，計數平板上發(fā)淺藍色熒光的菌落。

  2.結果判定

  兩個(gè)平板上發(fā)熒光菌落數的平均數乘以稀釋倍數，報告每g（mL）樣品中大腸埃希氏菌數，以CFU/g(mL)表示。若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無(wú)菌落生長(cháng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數報告。

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