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溶血性鏈球菌，顧名思義為有溶血作用的鏈球菌，革蘭氏陽(yáng)性菌，需氧或兼性厭氧培養。鏈球菌根據其對紅細胞的溶解作用程度不一，又可分為α（甲）、β（乙）、γ（丙）三型。其中β-溶血性鏈球菌，具有完全溶血作用，其在血平板上生長(cháng)產(chǎn)生的溶血素可在菌落在周?chē)纬梢粋�(gè)2-4mm、界限分明、完全透明的無(wú)色溶血環(huán)。α-溶血性鏈球菌產(chǎn)生的溶血環(huán)又稱(chēng)草綠色溶血，菌落周?chē)囵B基出現1-2mm的草綠色環(huán)。γ-鏈球菌不產(chǎn)生溶血素，無(wú)溶血環(huán)。
溶血性鏈球菌廣泛存在于水、空氣等自然環(huán)境及健康人和動(dòng)物的口腔、鼻腔、咽喉中，溶血性鏈球菌通常通過(guò)以下途徑污染食品：①食品加工人員及其他直接接觸人員有化膿性炎癥時(shí)手口鼻接觸或空氣飛沫污染。②食品原材料帶菌，如畜禽局部化膿。③熟制品因包裝不善而使食品受到污染。被污染的食品會(huì )使人類(lèi)通過(guò)直接接觸或皮膚、黏膜傷口等多種方式感染，危害極大，其中β溶血性鏈球菌危害最大。
本文將按不同標準對β溶血性鏈球菌的檢驗進(jìn)行介紹，以GB4789.11-2014《食品安全國家標準》為主。
一、GB4789.11-2014《食品安全國家標準》
（1）樣品處理及增菌培養
按無(wú)菌操作稱(chēng)取檢樣25g（25mL），加入盛有225mL mTSB的均質(zhì)容器（均質(zhì)袋、均質(zhì)杯、錐形瓶等）中，充分均質(zhì)，36±1℃培養18-24h。
mTSB對β溶血性鏈球菌進(jìn)行選擇性增菌。其中多粘菌素B通過(guò)破壞細菌外膜的完整性來(lái)抑制或殺滅革蘭氏陰性菌；萘啶酮酸則通過(guò)干擾DNA合成抑制大多革蘭氏陰性菌的繁殖；胨類(lèi)提供碳源、氮源和維生素等；葡萄糖提供可發(fā)酵糖類(lèi)；氯化鈉維持滲透壓；磷酸氫二鉀做為緩沖劑。此培養基不能抑制腸球菌和葡萄球菌等大多革蘭氏陽(yáng)性菌，故在后續檢驗中需將其排除。
（2）分離及純化培養
將增菌液劃線(xiàn)接種于哥倫比亞CNA血瓊脂平板，36±1℃厭氧培養18-24h。
β溶血性鏈球菌在哥倫比亞CNA血瓊脂平板上的典型菌落為邊緣整齊圓形、灰白色、半透明、表面光滑、有乳光凸起的的細小菌落，產(chǎn)生β溶血，如圖1、圖2所示。
圖1 β溶血性鏈球菌在血平板上的菌落特征
圖2 β溶血環(huán)
此步驟是厭氧培養，是因為溶血性鏈球菌多為兼性厭氧，可在厭氧環(huán)境下生長(cháng)，可減少樣品中其它專(zhuān)性需氧菌的干擾。通過(guò)菌落特征可將大多有色素的球菌與β溶血性鏈球菌區分，如葡萄球菌通常為不透明菌落。β溶血環(huán)的存在與否可將不溶血或α溶血的球菌與β溶血性鏈球菌區分，如部分葡萄球菌、部分腸球菌等。
（3）革蘭氏染色鏡檢及觸酶試驗
1、革蘭氏鏡檢
β溶血性鏈球菌為革蘭氏陽(yáng)性、球狀或卵圓形菌，鏈狀排列且長(cháng)短不一，一般為4-8個(gè)或幾十個(gè)細胞排列成鏈，無(wú)芽孢、無(wú)鞭毛、多數無(wú)莢膜。
β溶血性鏈球菌衰老培養物染色結果為革蘭氏陰性，故應取用新鮮培養物進(jìn)行染色；其在固體培養基上多為短鏈或葡萄狀，在液體中鏈狀較為典型，生長(cháng)如圖3所示。
圖3 β溶血性鏈球菌在BHI中24h培養物革蘭氏染色后鏡檢結果
2、觸酶試驗
β溶血性鏈球菌觸酶試驗為陰性。挑取可疑菌落于潔凈的載玻片上，滴加適量3%過(guò)氧化氫溶液，立即產(chǎn)生氣泡者為陽(yáng)性，如葡萄球菌、糖球菌；或者用玻璃棒或毛細管蘸取可疑菌落于3%過(guò)氧化氫溶液中，立即產(chǎn)生氣泡者為陽(yáng)性，如圖4所示。
注：此試驗必需保證純菌，不能混雜有其它菌或物質(zhì)，不能直接向平板上滴加3%過(guò)氧化氫溶液。
a：β溶血性鏈球菌；b：金黃色葡萄球菌
圖4 觸酶試驗結果
3、某些易混淆菌辨別
①溶血孿生球菌
溶血孿生球菌具有革蘭氏陽(yáng)性細胞壁、可厭氧生長(cháng)、在血平板上產(chǎn)生β溶血環(huán)、觸酶陰性，易與β溶血性鏈球菌混淆。其在血平板上為透明略凸起、邊緣不規則小菌落，可與β溶血性鏈球菌區分。其革蘭氏染色為陽(yáng)性但易褪色，故革蘭氏染色常見(jiàn)紅色紫色混合，常單個(gè)、成對或短鏈排列，成對排列時(shí)兩細胞相鄰面扁平。
②β溶血的腸球菌
腸球菌兼性厭氧、接觸酶陰性、在血平板上菌落狀態(tài)同溶血性鏈球菌相差不大（如圖5所示），革蘭氏染色液難以區分，且某些腸球菌能產(chǎn)生β溶血，此類(lèi)腸球菌可通過(guò)補加鏈激酶試驗或40%膽汁肉湯試驗來(lái)區分。β溶血性鏈球菌鏈激酶試驗為陽(yáng)性，腸球菌為陰性；40%膽汁肉湯試驗β溶血性鏈球菌為陰性（不生長(cháng)澄清），腸球菌為陽(yáng)性（生長(cháng)渾濁），如圖6所示。
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糞腸球菌 |
β溶血性鏈球菌 |
圖5 血平板劃線(xiàn)結果
a：空白對照；b：糞腸球菌；c：β溶血性鏈球菌
圖6 40%膽汁肉湯試驗結果
（四）生化鑒定（選做）
1、桿菌肽藥敏實(shí)驗
將可疑菌落的純培養物涂布于血瓊脂平板上，用滅菌鑷子取每片含有0.04單位的桿菌肽紙片，放于涂布后的瓊脂表面，需同時(shí)接種已知陽(yáng)性和陰性菌株作為對照，于36±1℃培養24h，如有抑菌帶出現即為陽(yáng)性，如圖7所示。
圖7 β溶血性鏈球菌桿菌肽藥敏實(shí)驗結果
注：此試驗于GB/T 14926.16-2001 《實(shí)驗動(dòng)物 乙型溶血性鏈球菌檢測方法》和GB 15979-2002《一次性使用衛生用品衛生標準》中為必做試驗。
2、40%膽汁生長(cháng)
配制40%膽汁肉湯，接種可疑菌10-100CFU，需同時(shí)接種已知陽(yáng)性菌和陰性菌作為對照，于36±1℃培養18-24h，生長(cháng)即為陽(yáng)性，澄清不生長(cháng)即為陰性。
注：此試驗不是必做試驗，當有些可疑菌落通過(guò)革蘭氏染色、菌落形態(tài)等難以辨別時(shí)，可選擇此試驗用以進(jìn)一步鑒定。
（五）鏈激酶試驗（選做）
吸取草酸鉀血漿0.2mL（0.01g草酸鉀加5 mL血漿混勻，經(jīng)離心沉淀，吸取上清液），加入0.8 mL無(wú)菌生理鹽水，混勻后再加入可疑菌18-24hTSB肉湯培養物0.5 mL和0.25%氯化鈣0.25 mL，混勻，置于36±1℃水浴中。待血漿凝固后（一般為10min，試管倒置不流動(dòng)），繼續水浴培養24h觀(guān)察結果，若血漿完全溶解則為陽(yáng)性，不溶解為陰性。β溶血性鏈球菌鏈激酶試驗為陽(yáng)性。
注：草酸鉀血漿在使用前需觀(guān)察是否變質(zhì)，變質(zhì)常表現為有凝塊，加入生理鹽水后不能呈完全溶解狀態(tài)，該狀態(tài)草酸鉀血漿不能使用，會(huì )影響后續結果判斷。加入可疑菌培養物和氯化鈣后應培養至血漿凝固才能繼續培養，若不能凝固則不能進(jìn)行后續試驗判斷。此試驗在GB 15979-2002《一次性使用衛生用品衛生標準》和GB/T 14923.16-2001《實(shí)驗動(dòng)物 微生物學(xué)檢驗方法》中為必做試驗。
二、關(guān)于溶血性鏈球菌的其它標準簡(jiǎn)單介紹
1、GB 15979-2002《一次性使用衛生用品衛生標準》B6溶血性鏈球菌檢驗方法：此標準中選用葡萄糖肉湯為增菌培養基，血瓊脂平板為分離純化培養基。鏡檢為革蘭氏陽(yáng)性鏈狀排列球菌、血平板上出現溶血圈、鏈激酶和桿菌肽試驗陽(yáng)性，可報告檢出溶血性鏈球菌。
2、GB/T 18204.3-2013《公共場(chǎng)所衛生檢驗方法》第3部分：空氣微生物β-溶血性鏈球菌：鏡檢、菌落特征符合描述，有β溶血環(huán)即可判定為β溶血性鏈球菌。注意此標準中血平板培養時(shí)間為24-48h。
3、GB/T 14923.16-2001《實(shí)驗動(dòng)物微生物學(xué)檢驗方法》乙型溶血性鏈球菌檢測方法：菌落特征和鏡檢菌體特征符合描述、鏈激酶試驗陽(yáng)性、桿菌肽敏感試驗陽(yáng)性，可報告檢出乙型溶血性鏈球菌。
4、SN/T 4624.5-2016《入境環(huán)保用微生物菌劑檢測方法》第5部分：β型溶血性鏈球菌：此標準從增菌到分離純化到形態(tài)學(xué)及生化鑒定與GB4789.11-2014《食品安全國家標準》無(wú)明顯區別，具體可參照國標介紹。
5、DB15/T 2071-2021《內蒙古自治區地方標準》動(dòng)物墊料中β-溶血性鏈球菌檢測：此標準從增菌到分離純化到形態(tài)學(xué)及生化鑒定與GB4789.11-2014《食品安全國家標準》無(wú)明顯區別，具體可參照國標介紹。
6、SN/T 2754.9-2011《出口食品中致病菌環(huán)介導恒溫擴增（LAMP）檢測方法》第9部分：溶血性鏈球菌。
注：本文屬海博生物原創(chuàng )，未經(jīng)允許不得轉載。
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