霍亂弧菌檢驗方法及結果判斷

一、前言

  1.生物學(xué)特征

  霍亂弧菌(Vibrio cholerae)為革蘭氏陰性菌，呈弧形或逗點(diǎn)狀，無(wú)芽胞，有菌毛，有些菌株有莢膜，一端有一根粗而長(cháng)的鞭毛，運動(dòng)活潑。取霍亂病人米泔水樣糞便作活菌懸滴觀(guān)察，可見(jiàn)細菌運動(dòng)極為活潑，呈穿梭樣或流星狀運動(dòng)。液體培養物滴片染色鏡檢，可見(jiàn)排列如“魚(yú)群狀”弧菌。經(jīng)人工培養后，易失去弧形而呈桿狀。

  營(yíng)養要求不高，在普通培養基上生長(cháng)良好，在pH 6.8-10.2范圍均可生長(cháng)，耐堿，在pH 8.8-9.0的堿性蛋白胨水或平板中生長(cháng)良好，因其他細菌在這pH不易生長(cháng)，故堿性蛋白胨水可作為選擇性增殖霍亂弧菌的培養基。

  在堿性平板上菌落直徑為2mm，圓形，光滑，透明�；魜y弧菌對熱，干燥，日光，化學(xué)消毒劑和酸均很敏感，耐低溫：濕熱55℃，15分鐘，100℃，1-2分鐘，水中加0.5ppm氯15分鐘可被殺死；0.1%高錳酸鉀浸泡蔬菜、水果可達到消毒目的；在正常胃酸中僅生存4分鐘�；魜y弧菌為需氧或兼性厭氧菌，在16-44℃均可生長(cháng)，最適生長(cháng)溫度37℃。

  2.流行病學(xué)特征

  霍亂弧菌(Vibrio cholerae)是霍亂的病原菌，該病為一種急性烈性腸道傳染病，主要表現為劇烈的嘔吐，腹瀉，失水，發(fā)病急，傳染性強，死亡率高，屬于國際檢疫傳染病。共分為139個(gè)血清群，其中O1群和O139群可引起霍亂�；魜y弧菌O1群和O139群是烈性腸道傳染病霍亂的病原體。在自然情況下，人類(lèi)是霍亂弧菌的易感者。人通過(guò)攝入霍亂弧菌污染的食物或水，引起霍亂。進(jìn)入腸道的霍亂弧菌通過(guò)鞭毛運動(dòng)穿過(guò)腸黏膜表面的黏液層，接近腸黏膜上皮細胞，通過(guò)普通菌毛的作用定植。腸道內的環(huán)境有利于霍亂弧菌的繁殖，產(chǎn)生霍亂腸毒素，導致疾病的發(fā)生。

  霍亂弧菌的主要致病因素是霍亂毒素（cholera toxin，CT），CT是目前已知的致瀉毒素中最強烈的毒素,可造成腸液大量分泌，導致嚴重的嘔吐和腹瀉，使體內水分和電介質(zhì)大量丟失，形成嚴重的水樣腹瀉綜合征�；魜y弧菌造成的主要病變均由嚴重脫水引起，臨床可見(jiàn)指紋皺縮，皮下組織及肌肉干癟。心、肝、脾等臟器均見(jiàn)縮小。內臟漿膜無(wú)光澤。腸腔高度擴張、腸內充滿(mǎn)泔水樣液體，腸粘膜松弛，但粘膜上皮完整，無(wú)潰瘍。膽囊內充滿(mǎn)粘稠膽汁。腎小球及間質(zhì)的毛細管擴張，腎小管腫脹、變性及壞死。其他臟器也有出血、變性等變化。 

二、檢驗過(guò)程

  試驗參考標準為《SN/T 1022—2010 進(jìn)出口食品中霍亂弧菌檢驗方法》。本標準規定了進(jìn)出口食品中霍亂弧菌（Vibrio cholerae）的檢驗方法，適用于食品中霍亂弧菌的檢驗，動(dòng)物飼料和其他食品生產(chǎn)和加工區域環(huán)境樣品中的霍亂弧菌檢驗可參照使用。

  霍亂弧菌檢驗程序如圖1：

   圖1

  1.培養基鑒定及結果判斷

  ①TCBS培養基

  原理：蛋白胨、酵母浸粉提供碳氮源、維生素和生長(cháng)因子；氯化鈉可刺激弧菌的生長(cháng)；蔗糖是可發(fā)酵的糖類(lèi)；牛膽酸鈉、牛膽粉、硫代硫酸鈉和枸櫞酸鈉及較高的pH 可抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和大腸菌群；硫代硫酸鈉與檸檬酸鐵反應作為檢測硫化氫產(chǎn)生的指示劑；溴麝香草酚藍和麝香草酚藍是pH指示劑；瓊脂是培養基的凝固劑。

  使用方式：稱(chēng)取本品89g，煮沸溶解于1000ml蒸餾水中，冷至45-50℃時(shí)，傾入無(wú)菌平皿，備用。注：無(wú)需高壓滅菌。

  結果：霍亂弧菌在TCBS上呈圓形，表面光滑，黃色，直徑2mm～3mm，具體試驗結果如圖2：

圖2 霍亂弧菌非01 TCBS培養基生長(cháng)結果

  ②慶大霉素瓊脂培養基

  原理：蛋白胨、牛肉浸粉提供氮源、維生素、礦物質(zhì)和生長(cháng)因子；蔗糖提供碳源；氯化鈉即用于滿(mǎn)足霍亂弧菌嗜鹽生長(cháng)的要求，同時(shí)形成了不利于其他細菌生長(cháng)的高滲透壓；亞硫酸鈉可刺激弧菌生長(cháng)；慶大霉素和亞碲酸鉀及較高的pH值，可抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和部分革蘭氏陰性雜菌的生長(cháng)；枸櫞酸鈉可使得霍亂弧菌免受其他抑菌物質(zhì)的影響；霍亂弧菌對酸性環(huán)境比較敏感，因此該pH 值可促進(jìn)其生長(cháng)；瓊脂是培養基的凝固劑。

  使用方式：稱(chēng)取本品56.0g，加熱攪拌溶解于1000ml蒸餾水中，冷至50℃左右時(shí)，加入無(wú)菌1%亞碲酸鉀溶液0.5ml，混勻，傾入無(wú)菌平皿，備用。無(wú)需高壓滅菌。

  結果：霍亂弧菌在慶大霉素瓊脂培養基上略帶青灰色，半透明，扁平微隆起，如延長(cháng)培養或室溫放置，菌落中心形成黑色金屬碲沉淀，具體試驗結果如圖3：

菌落略帶青灰色，半透明，扁平微隆起	菌落中心形成黑色金屬碲沉淀

圖3 霍亂弧菌非01慶大霉素瓊脂培養基生長(cháng)結果

  ③氯化鈉三糖鐵瓊脂

  原理：蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉提供碳氮源、維生素和礦物質(zhì)；乳糖、葡萄糖、蔗糖為可發(fā)酵糖類(lèi)，其被分解產(chǎn)酸時(shí)通過(guò)苯酚紅酸堿指示劑測出，酸性呈黃色，堿性呈紅色；因某些細菌能分解含硫氨基酸，生成硫化氫，硫化氫和培養基中的鐵鹽反應生成黑色的硫化亞鐵沉淀；較高含量的氯化鈉可促進(jìn)弧菌的生長(cháng)；瓊脂是培養基的凝固劑。

  使用方式：稱(chēng)取本品69.5g，加入1000ml蒸餾水中，加熱煮沸使完全溶解，分裝試管，121℃高壓滅菌15分鐘，備用。

  結果：霍亂弧菌在氯化鈉三糖鐵斜面上的反應為底層黃色，斜面黃色，不產(chǎn)生硫化氫，不產(chǎn)氣，具體試驗結果如圖4：

圖4 氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面試驗結果

  ④氯化鈉營(yíng)養瓊脂

  原理：蛋白胨、牛肉浸粉提供微生物生長(cháng)所需的碳氮源、維生素和生長(cháng)因子；高含量的氯化鈉可促進(jìn)霍亂弧菌的生長(cháng)；瓊脂是培養基的凝固劑。

  使用方式：稱(chēng)取本品36.0g，加熱溶解于1000ml蒸餾水中，分裝三角瓶或試管，121℃高壓滅菌15min，備用。

  結果：霍亂弧菌在氯化鈉營(yíng)養瓊脂培養基上純化培養后菌落呈圓形，邊緣半透明中央不透明，直徑為3mm左右，具體試驗結果如圖5：

圖5 霍亂弧菌非01氯化鈉營(yíng)養瓊脂培養基生長(cháng)結果

  2.生化鑒定及結果判斷

  ①革蘭氏染色

  所用試劑：革蘭氏染色液試劑盒。

  原理：通過(guò)結晶紫初染和碘液媒染后，在細胞壁內形成了不溶于水的結晶紫與碘的復合物，革蘭氏陽(yáng)性菌由于其細胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，遇乙醇或丙酮脫色處理時(shí)，因失水反而使網(wǎng)孔縮小，再加上它不含類(lèi)脂，因此，能把結晶紫與碘復合物牢牢留在壁內，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、外膜層類(lèi)脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類(lèi)脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結晶紫與碘復合物的溶出，因此通過(guò)乙醇脫色后仍呈無(wú)色，再經(jīng)沙黃等紅色染料復染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。

  結果：霍亂弧菌為革蘭氏陰性菌，呈弧形或彎曲狀，染色結果如圖6：

圖6 霍亂弧菌革蘭氏染色結果

  ②氧化酶試驗

  所用試劑：氧化酶試紙。

  原理：氧化酶亦即細胞色素氧化酶，為細胞色素呼吸酶系統的終末呼吸酶，氧化酶先使細胞色素c氧化，然后此氧化型細胞色素c再使對苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應。用細玻璃棒或一次性接種針挑取單個(gè)菌落，涂在試紙上。在30s內變?yōu)樗{色或藍紫色為陽(yáng)性，不變色為陰性。

  結果：挑選營(yíng)養瓊脂上純培養的單個(gè)菌落進(jìn)行氧化酶試驗，霍亂弧菌為氧化酶陽(yáng)性，試驗結果如圖7：

a:陰性試驗結果；b:霍亂弧菌非01

圖7 氧化酶試驗結果

  ③生化鑒定條試驗

  所用試劑：青島海博HBI霍亂弧菌生化鑒定條（SN）。

  試劑介紹：用于霍亂弧菌的生化鑒定。組成：ONPG、尿素酶、明膠、精氨酸雙水解酶肉湯、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶肉湯、賴(lài)氨酸脫羧酶肉湯、氨基酸脫羧酶對照、無(wú)鹽胰胨水、2%氯化鈉胰胨水、6%氯化鈉胰胨水、8%氯化鈉胰胨水、10%氯化鈉胰胨水、靛基質(zhì)、1%氯化鈉乳糖、1%氯化鈉纖維二糖、1%氯化鈉阿拉伯糖、1%氯化鈉蔗糖、1%氯化鈉甘露糖、42℃生長(cháng)試驗。(SN標準)。

  操作過(guò)程：取一內盛2ml無(wú)菌生理鹽水試管，用接種針從氯化鈉營(yíng)養瓊脂平板上挑取部分菌落至無(wú)菌生理鹽水中，仔細研磨制成0.5麥氏濁度的均一細菌懸液，取一無(wú)污染的生化鑒定條，每孔加入100ul菌懸液，其中固體和半固體生化管采用穿剌接種，鳥(niǎo)氨酸、精氨酸、賴(lài)氨酸和氨基酸對照需加滅菌石蠟覆蓋液面。接種完后做好標記，蓋上蓋子，放入底托中，放置36℃±1℃培養（42℃生長(cháng)置42℃培養）。培養結束后，記錄試驗結果。具體試驗結果如圖8：

圖8 霍亂弧菌非01生化鑒定條結果

霍亂弧菌非01生化鑒定結果表

  注意事項：1.靛基質(zhì)試驗過(guò)程中，在培養結束后需加Kovacs氏靛基質(zhì)試劑2-4滴，混勻后4h內觀(guān)察結果；2.鳥(niǎo)氨酸、精氨酸、賴(lài)氨酸和氨基酸對照需加滅菌液體石蠟覆蓋液面。

三、結果總結

  霍亂弧菌在TCBS上呈圓形，表面光滑，黃色，直徑2mm～3mm；在慶大霉素瓊脂培養基上略帶青灰色，半透明，扁平微隆起，如延長(cháng)培養或室溫放置，菌落中心形成黑色金屬碲沉淀；在氯化鈉三糖鐵斜面上的反應為底層黃色，斜面黃色，不產(chǎn)生硫化氫，不產(chǎn)氣；在氯化鈉營(yíng)養瓊脂培養基上純化培養后菌落呈圓形，邊緣半透明中央不透明，直徑為3 mm左右；經(jīng)革蘭氏染色試驗鑒定為革蘭氏陰性，呈弧形或彎曲狀；在氧化酶試紙上呈紫色，為陽(yáng)性實(shí)驗結果；在無(wú)鹽蛋白胨胨水和2%氯化鈉蛋白胨水中生長(cháng)；6%氯化鈉蛋白胨水、8%氯化鈉蛋白胨水生長(cháng)旺盛為陽(yáng)性和10%氯化鈉蛋白胨水中不生長(cháng)；ONPG為陽(yáng)性；尿素酶為陰性；明膠為陽(yáng)性；鳥(niǎo)氨酸、賴(lài)氨酸脫羧酶陽(yáng)性；氨基酸對照和精氨酸為陰性；蔗糖、甘露醇為陽(yáng)性；乳糖、纖維二糖和阿拉伯糖為陰性；靛基質(zhì)試驗為陽(yáng)性；在42℃恒溫培養箱中生長(cháng)。除上述試驗，對霍亂弧菌的檢測亦可選做血清學(xué)分型等相關(guān)試驗。

  注：本文屬海博生物原創(chuàng )，未經(jīng)允許不得轉載。

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