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一、參考標準
《GB5413.14-2010食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測定》
二、方法原理
利用萊士曼氏乳酸桿菌（Lactobacillus leichmannii）對維生素B12的特異性和靈敏性，定量測定出試樣中維生素B12的含量。
在測定用培養基中供給除維生素B12以外的所有營(yíng)養成分，這樣萊士曼乳桿菌生長(cháng)濃度（吸光度）就會(huì )同標準曲線(xiàn)工作液及未知待測溶液中維生素B12的含量呈正比的線(xiàn)性關(guān)系。以不同濃度標準溶液的維生素B12含量為橫軸，以萊士曼乳桿菌生長(cháng)濃度（吸光度）為縱軸，即可繪制標準曲線(xiàn)，根據標準曲線(xiàn)即可計算出試樣中維生素B12的含量。
三、試驗用品及預處理
（1）培養基：維生素B12測定用培養基；
（2）磷酸氫二鈉、無(wú)水偏重亞硫酸鈉、檸檬酸、生理鹽水、25%乙醇、純化水等；
（3）容器：試管、移液管、容量瓶、量筒、玻璃棒、錐形瓶。
注意事項：
①本方法所用試劑均為分析純試劑，水為GB/T 6682規定的二級水。水的潔凈程度對本試驗至關(guān)重要，若水中有維生素B12殘留或接觸了有維生素B12殘留的容器，將直接影響到試驗結果。
②試驗中使用的玻璃器具需洗凈后在200℃烘至少2h，必要時(shí)可預先用1mol/L的稀鹽酸浸泡再烘，充分去除容器中可能殘留的維生素B12。
③使用的維生素B12測定培養基需確保不含有維生素B12，其他營(yíng)養齊全。若自行配制培養基，需確保原材料中不含有維生素B12，制備過(guò)程不可污染維生素B12。
四、標準溶液的制備
（1）維生素B12貯備液（10μg/mL）：精確稱(chēng)取維生素B12標準品，用25%乙醇溶液定容至維生素B12濃度為10μg/mL。
（2）維生素B12中間液（100ng/mL）：用25%乙醇溶液將5.0mL維生素B12貯備液定容至500mL。
（3）維生素B12工作液（1ng/mL）：用25%乙醇溶液將5.0mL維生素B12中間液定容至500mL。
（4）標準曲線(xiàn)工作液：分別吸取兩個(gè)5mL維生素B12工作液于250mL和500mL容量瓶中，用水定容至刻度。高濃度溶液的濃度為0.02ng/mL；低濃度溶液的濃度為0.01ng/mL。
注意事項：
①標準溶液配制過(guò)程中使用的溶劑、容器必須確保無(wú)維生素B12殘留。
②所有標準溶液要儲存于冰箱內。維生素B12貯備液、中間液、工作液可保存三個(gè)月，標準曲線(xiàn)工作液臨用前配制。
五、菌株活化及菌懸液制備
（1）將萊士曼氏乳酸桿菌（ATCC 7830）菌株活化后，接種到乳酸桿菌瓊脂培養基上，36±1℃培養24h。再轉種2代～3代來(lái)增強活力。置2～5℃冰箱保存備用。每15d轉種一次。
（2）將活化后的菌株接種到乳酸桿菌肉湯培養基中，36±1℃培養18h～24h，以2000轉/分鐘離心2～3min，棄去上清液，加入10mL生理鹽水，振蕩懸浮混勻，再離心2～3min，棄去上清液，再加入10mL生理鹽水，振蕩懸浮混勻。再離心，棄去上清液。再加10mL生理鹽水，振蕩懸浮混勻。吸適量該菌懸液于10mL生理鹽水中，混勻制成透光率為60%-80%的測試菌液（以生理鹽水做空白，用分光光度計測550nm波長(cháng)下的透光率）。
注意事項：
①萊士曼乳桿菌初次復蘇時(shí)活力較差，生長(cháng)緩慢，必須連續轉接傳代2-3代或更多代數至菌株活力旺盛，方可用于試驗。
②萊士曼乳桿菌可連續傳代數十次仍然保持菌株特性穩定，可在傳代5次之后繼續使用（多數標準都規定傳代次數一般不可超過(guò)5代，而萊士曼乳桿菌可以多次傳代）。
③制備菌株過(guò)程需注意嚴格進(jìn)行無(wú)菌操作，防止污染雜菌。
④制備菌懸液過(guò)程中的重復離心-去上清-生理鹽水懸浮步驟目的為洗去活化培養基中的維生素殘留，不可省略或減少清洗次數，若清洗不干凈，可能會(huì )對試驗結果造成不良影響。
六、樣品處理
（1）稱(chēng)取無(wú)水磷酸氫二鈉1.3g，無(wú)水偏重亞硫酸鈉1.0g，檸檬酸（含一個(gè)結晶水）1.2g，用100mL水溶解。
（2）稱(chēng)一定量的樣品 (精確到0.0001g)，含維生素B12約50-100ng，用10mL的上述溶液混合后，再加150mL水，于121℃水解10min，冷卻后調pH至4.5±0.2，再用水定容至250mL，過(guò)濾。移取濾液5mL，加入水20～30mL，調pH至6.8±0.2，用水定容至100mL。最終溶液中維生素B12的質(zhì)量濃度約在0.01 ng/mL～0.02ng/mL，偏重亞硫酸鈉的質(zhì)量濃度小于0.03mg/mL。
七、試驗步驟
（1）標準曲線(xiàn)制作：按下表順序加入水、標準曲線(xiàn)工作液和維生素B12測定用培養基于試管中，做3個(gè)平行組。
|
試管 |
S1 |
S2 |
S3 |
S4 |
S5 |
S6 |
S7 |
S8 |
S9 |
S10 |
|
水（mL） |
5 |
5 |
4 |
3 |
2 |
1 |
0 |
2 |
1 |
0 |
|
0.01ng/mL標準曲線(xiàn)工作液（mL） |
0 |
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
0 |
0 |
0 |
|
0.02ng/mL標準曲線(xiàn)工作液（mL） |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
3 |
4 |
5 |
|
培養基（mL） |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
（2）待測液的制作：按下表順序加入水、樣品溶液和維生素B12測定培養基于試管中，做3個(gè)平行組。
|
試管 |
1 |
2 |
3 |
4 |
|
水（mL） |
4 |
3 |
2 |
1 |
|
待測液（mL） |
1 |
2 |
3 |
4 |
|
培養基（mL） |
5 |
5 |
5 |
5 |
（3）滅菌：將所有試管置于121℃滅菌5min，滅菌結束后，迅速冷卻至30℃以下。
注意事項：不可滅菌時(shí)間過(guò)長(cháng)或長(cháng)時(shí)間在滅菌鍋中保溫，防止培養基中維生素成分過(guò)量降解；滅菌后的培養基宜當天使用。
（4）接種：用滴管或移液器向上述試管中各滴加1滴（約50μL）測試菌液（其中標準曲線(xiàn)管中空白S1除外）。
（5）培養：將試管放入恒溫培養箱內，36±1℃培養19h～20h。
（6）觀(guān)察：培養結束后，對每支試管進(jìn)行目測檢查，未接種試管S1內培養液應是澄清的，如果出現渾濁，則測定無(wú)效。以接種空白管做對照，測定最高濃度標準曲線(xiàn)試管的透光率，2h后重新測定。兩次結果透光率差值若小于2%，則取出全部檢驗管測其透光率。
注意事項：若S1試管出現渾濁，可能是滅菌不徹底出現了污染；若S2出現明顯渾濁，可能是培養基中有維生素B12污染或接種的菌液污染雜菌；兩次測定最高濃度標準曲線(xiàn)的透光率差值若＜2%，說(shuō)明細菌生長(cháng)已達峰值，可進(jìn)行測定，反之則需繼續培養至最高濃度，方可取出進(jìn)行測定。
（7）測定：用未接種試管（S1）作空白，將分光光度計透光率調到100%（或吸光度為0），讀出接種空白試管（S2）的讀數。再以接種空白試管（S2）為空白，調節透光率為100%（或吸光度為 0），依次讀出其他每支試管的透光率（或吸光度）。
用渦旋混合器充分混合每一支試管（也可以加一滴消泡劑）后，立即將培養液移入比色皿內進(jìn)行測定，波長(cháng)為550nm，待讀數穩定30s后，讀出透光率（或吸光度），每支試管穩定時(shí)間要相同。
注意事項：在進(jìn)行吸光度測定時(shí)，測量的OD值在0.2-0.8之間相對更準確，線(xiàn)性關(guān)系更好，若測得OD值超出范圍，可進(jìn)行倍數稀釋再進(jìn)行測定。
（8）標準曲線(xiàn)制作及計算：以維生素B12標準品的含量為橫坐標，透光率（吸光度）為縱坐標作標準曲線(xiàn)。
根據待測液的透光率（吸光度），從標準曲線(xiàn)中查得該待測液中維生素B12的濃度，再根據稀釋因子和稱(chēng)樣量計算出試樣中維生素B12的含量。透光率（吸光度）超出標準曲線(xiàn)管S3～S10范圍的試樣管要舍去。
對每個(gè)編號的待測液的試管，用每支試管的透光率（吸光度）計算每毫升該編號待測液維生素B12的濃度，并計算該編號待測液的維生素B12濃度平均值，每支試管測得的該濃度不得超過(guò)該平均值的±15%，超過(guò)者要舍去。如果符合該要求的管數少于所有的四個(gè)編號的待測液的總管數的2/3，用于計算試樣含量的數據是不充分的，需要重新檢驗。如果符合要求的管數超過(guò)原來(lái)管數的2/3，重新計算每一編號的有效試樣管中每毫升測定液中維生素B12含量的平均值，以此平均值計算全部編號試樣管的總平均值為Cx。 用于計算試樣中的維生素B12含量。
維生素B12的含量按公式計算：X=Cx/m*f/1000*100
注：X是試樣中維生素B12的含量，單位為μg/100g；Cx是計算所得的維生素B12含量總平均值，單位為ng；m是試樣的質(zhì)量，單位為g；f是稀釋倍數。
以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的算術(shù)平均值表示，結果保留兩位有效數字。
八、實(shí)驗現象及標準曲線(xiàn)制作
（1）實(shí)驗現象：S3-S10試管呈梯度渾濁
（2）標準曲線(xiàn)制作
九、試驗關(guān)鍵點(diǎn)總結
（1）試驗用使用的玻璃容器、水、培養基等必須確保無(wú)維生素B12殘留，整個(gè)試驗過(guò)程操作要注意不能污染維生素B12，否則會(huì )導致標準曲線(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系差或做不出標準曲線(xiàn)；
（2）標準溶液制備過(guò)程中必須精確稱(chēng)量、定容，若配制的標準溶液誤差過(guò)大會(huì )直接影響最終測定結果；
（3）使用的萊士曼乳桿菌要連續進(jìn)行傳代至活力旺盛，且無(wú)雜菌污染；在進(jìn)行菌體離心-懸浮清洗的重復操作時(shí)，需確保清洗干凈，不能有活化培養基殘留，殘留的培養基中可能含有維生素B12，對試驗結果造成不良影響；
（4）進(jìn)行OD值測定時(shí)，盡可能保證測得吸光度范圍在0.2-0.8之間，若超出此范圍，可使用空白培養基進(jìn)行倍數稀釋后再進(jìn)行測定。
注：本文屬海博生物原創(chuàng )，未經(jīng)允許不得轉載。
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