肺炎克雷伯氏菌檢驗

一、參考標準

  《SN/T 2206.3-2009 中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準 化妝品微生物檢驗方法 第3部分：肺炎克雷伯氏菌》。

二、生物學(xué)特征

  革蘭氏陰性桿菌，為較短粗的桿菌，大小0.5～0.8×1～2 um，單獨、成雙或短鏈狀排列。無(wú)芽胞，無(wú)鞭毛，有較厚的莢膜，多數有菌毛。營(yíng)養要求不高，在普通瓊脂培養基上形成較大的灰白色粘液菌落，以接種環(huán)挑之，易拉成絲，有助鑒別。在腸道桿菌選擇性培養基上能發(fā)酵乳糖，呈現有色菌落。

三、檢驗程序

圖1 肺炎克雷伯氏菌檢驗程序

四、檢驗方法及結果

  1、增菌

  肺炎克雷伯氏菌在SCDLP液體培養基中36±1℃培養18-24h后生長(cháng)渾濁。如圖2所示。

a:空白對照 b:肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117

圖2 SCDLP液體培養基培養結果

  2、選擇性分離

  自SCDLP培養液中，取1-2接種環(huán)，劃線(xiàn)接種于膽硫乳瓊脂平板（DHL）上，置36±1℃ 培養18-24 h。

  在DHL平板上肺炎克雷伯氏菌菌落呈淡粉紅色，大而隆起，光滑濕潤，粘液狀，相鄰菌落容易融合成膿汁樣，接種針挑取菌落時(shí)呈絲狀粘連。如圖3所示。

圖3 肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117在DHL平板上的培養結果

五、初步生化鑒定

  從DHL平板上至少挑取5個(gè)典型或可疑菌落，如果平板上可疑菌落少于5個(gè)，則全部挑取，把挑取的可疑菌落分別穿刺于動(dòng)力半固體瓊脂，并接種到營(yíng)養瓊脂斜面培養基，36±１℃培養18-24 h。將營(yíng)養瓊脂斜面培養基上的純培養物做革蘭氏染色、氧化酶試驗。

  1、動(dòng)力半固體瓊脂

  肺炎克雷伯氏菌在動(dòng)力半固體培養基中無(wú)動(dòng)力，延穿刺線(xiàn)生長(cháng)。如圖4所示，相比較大腸埃希氏菌在動(dòng)力半固體培養基中有動(dòng)力，呈擴散生長(cháng)，培養基會(huì )出現渾濁現象。

a:大腸埃希氏菌ATCC 25922 b:肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117

圖4 動(dòng)力半固體培養基培養結果

  2、革蘭氏染色

  肺炎克雷伯氏菌染色結果為紅色，為革蘭氏陰性菌。

圖5

  3、氧化酶試驗

  肺炎克雷伯氏菌氧化酶試驗不變色，為陰性。如圖6所示，相比較銅綠假單胞菌變藍為陽(yáng)性。

a:銅綠假單胞菌ATCC 9027   b:肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117

圖6 氧化酶試驗結果

六、后續生化鑒定

  挑取無(wú)動(dòng)力，革蘭氏染色陰性，氧化酶試驗陰性的菌進(jìn)行后續生化鑒定。

  1、尿素酶試驗

  劃線(xiàn)接種于尿素酶生化管培養基中，培養基變?yōu)榉奂t色，為陽(yáng)性。相比較鼠傷寒沙門(mén)氏菌不變色，為陰性。

a:空白對照  b:肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117  c:鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028

圖7 尿素酶鑒定試驗結果

  2、靛基質(zhì)生化鑒定試驗

  將菌接種于胰蛋白水培養基中，36±1℃培養24±2h。培養結束后，滴加Kovacs氏靛基質(zhì)試劑2-4滴，立即觀(guān)察現象。肺炎克雷伯氏菌為黃色環(huán)，為陰性。相比較大腸埃希氏菌為玫紅色環(huán)，為陽(yáng)性。

a:空白對照  b:肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117  c:大腸埃希氏菌ATCC25922

圖8 靛基質(zhì)鑒定試驗結果

  3、MR鑒定試驗

  用MR-VP培養基培養結束后，滴加甲基紅試劑，立即觀(guān)察現象，肺炎克雷伯氏菌顯黃色，為陰性。相比較大腸埃希氏菌顯紅色，為陽(yáng)性。

a:空白對照  b:肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117  c:大腸埃希氏菌ATCC25922

圖9 MR鑒定試驗結果

  4、V-P鑒定試驗

  用MR-VP培養基培養結束后，滴加V-P試劑，繼續培養0.5-4 h，觀(guān)察現象。肺炎克雷伯氏菌變紅，為陽(yáng)性。相比較大腸埃希氏菌為黃色，為陰性。

a:空白對照  b:肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117  c:大腸埃希氏菌ATCC25922

圖10 V-P鑒定試驗結果

  5、西蒙氏枸櫞酸鹽利用試驗

  劃線(xiàn)接種于西蒙氏枸櫞酸鹽培養基上，培養基變藍，為陽(yáng)性。

a:空白對照  b:肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117

圖11 西蒙氏枸櫞酸鹽培養基培養結果

  6、賴(lài)氨酸脫羧酶鑒定試驗

  接種于賴(lài)氨酸脫羧酶肉湯生化管中，用無(wú)菌液體石蠟覆蓋培養基液面，培養18-24 h。觀(guān)察現象，肺炎克雷伯氏菌培養基呈紫色，為陽(yáng)性。相比較，福氏志賀氏菌培養基呈黃色，為陰性。

a:空白對照  b:肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117  c:福氏志賀氏菌ATCC12022

圖12 賴(lài)氨酸脫羧酶鑒定試驗結果

  注：肺炎克雷伯氏菌生化特性見(jiàn)下表。

  注：本文屬海博生物原創(chuàng )，未經(jīng)允許不得轉載。

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