選用和設計培養基的原則、方法及制備過(guò)程

   
   選用和設計培養基的原則,方法及制備過(guò)程:
原則:目的明確 ,營(yíng)養協(xié)調,經(jīng)濟節約物理化學(xué)條件適宜
方法:生態(tài)模擬,查閱文獻精心設計,試驗比較 
步驟:稱(chēng)量,熔化,調PH,過(guò)濾,分裝,加塞,包扎,滅菌,冷卻,無(wú)菌檢查
培養基種類(lèi):
一,按成分的不同分
天然培養基,合成培養基,半合成培養基
二,按培養基的物理狀態(tài)分
固體培養基,液體培養基,半固體培養基
三,按培養基用途
基礎培養基,選擇培養基
加富培養基,鑒別培養基
消毒與滅菌
消毒:消滅病原菌和有害微生物的營(yíng)養體
滅菌:殺滅一切微生物的營(yíng)養體,芽胞和孢子.
方法:
一,物理的方法:加熱,過(guò)濾,輻射
二,化學(xué)的方法:用化學(xué)試劑抑制或殺滅微生物.主要破壞細菌代謝機能.如重金屬離子,磺胺類(lèi)藥物及抗生素等. 
加熱法:
干熱法:火焰灼燒滅菌和熱空氣滅菌.
1,火焰灼燒適用于接種環(huán),接種針和金屬用具如鑷子等,試管口和瓶口,涂布用玻璃棒.
2,熱空氣滅菌利用高溫干燥空氣(160-170C)加熱滅菌1-2h,適用于玻璃器皿和培養皿等.原理加熱使蛋白質(zhì)變性,與水的含量有關(guān),當環(huán)境和細胞含水量越大,凝固越快.
3,注意事項:
1)培養基,橡膠制品,塑料制品不能用此法;
2)溫度控制在<180°;
3)物品不能太擠;
4)溫度降至70°時(shí)才開(kāi)箱門(mén). 
濕熱法 :
原理:因為濕熱中菌體吸水,蛋白質(zhì)容易凝固,因蛋白質(zhì)含水量增加,所需凝固溫度降低;濕熱的蒸氣有潛熱存在.所以效果比同溫度下干熱好.
高壓蒸汽滅菌法:
1,設備:高壓滅菌鍋
2,時(shí)間長(cháng)短根據滅菌物品的種類(lèi)和數量不同有所變化.
3,適用于培養基,工作服,橡膠物品等的滅菌,也可用于玻璃器皿的滅菌.
4,注意事項:
1)冷空氣徹底排除;2)加水;3)壓力降為"0"時(shí)方可打開(kāi). 
常壓蒸汽滅菌:
對于不宜用高壓蒸汽滅菌的培養基如明膠培養基,牛乳培養基,含糖培養基等可采用此法.徹底滅菌則采用間歇滅菌方法.
煮沸滅菌法:
適用注射器和解剖器皿,時(shí)間10-15min,
超高溫殺菌 
135-150°C和2-8s對牛乳和其它液態(tài)食品.
優(yōu)點(diǎn) :保持食品價(jià)值和營(yíng)養成分.
過(guò)濾除菌:
原理:介質(zhì)在有壓力時(shí)阻隔微生物.
適用范圍:許多材料如血清,抗生素及糖溶液采用此法.
設備:蔡氏過(guò)濾器,濾膜過(guò)濾器.
優(yōu)缺點(diǎn):不破壞培養基成分,只適用少量濾液.需 大量無(wú)菌空氣以及凈化工作臺. 
注意事項:1,壓力適當;
2,無(wú)菌條件下進(jìn)行;
3,防止滲透現象. 
輻射滅菌:
原理:紫外線(xiàn)波長(cháng)在200-300nm,具有殺菌作用,以265-266殺菌力強.此段波長(cháng)易被細胞中核酸吸收;可產(chǎn)生臭氧和過(guò)氧化氫.殺菌效力與強度和時(shí)間的乘積成正比.
缺點(diǎn):穿透力不大.距照射物<1.2m為宜.
應用:無(wú)菌室,醫院.
注意事項:對眼睛和皮膚有刺激作用.
射線(xiàn)滅菌:r射線(xiàn),穿透力強,適用于堆積物品的滅菌. 
化學(xué)藥品滅菌:
原理:應用化學(xué)制劑破壞細菌代謝機能.
殺菌劑如重金屬離子;
抑菌劑如磺胺類(lèi)及多數抗生素.
注意:與藥品的濃度高低,時(shí)間長(cháng)短,微生物種類(lèi)以及微生物所處的環(huán)境有關(guān).
常用化學(xué)殺菌劑有:乙醇,醋酸,石碳酸
福爾馬林,升汞,高錳酸鉀,新潔爾滅等
實(shí)驗二,微生物的分離,純化及培養技術(shù)
分離與純化:從混雜的微生物群體中獲得只含某一種或某一株微生物的過(guò)程.
為什么要進(jìn)行純培養:平板上的單一菌落并不一定保證是一種菌.
常用的分離,純化方法:
單細胞挑取法 稀釋涂布平板法
稀釋混合平板法 平板劃線(xiàn)法 
稀釋涂布平板法 :
原理:
步驟: 1,倒平板: 牛肉膏蛋白胨培養基,高氏I號培養基,查氏培養基冷卻至55-60℃時(shí),混勻后倒平板,牛肉膏蛋白胨培養基倒4皿,高氏I號培養基和查氏培養基各倒3皿.
2,制備污水稀釋液:10g土樣,加入90ml無(wú)菌水中,在三角瓶中振搖20min.取0.5ml 加入盛有4.5ml無(wú)菌水的試管中,以此類(lèi)推,制成不同稀釋度.
3,涂布:將上述每種培養基平板底面標記稀釋度,然后用無(wú)菌吸管從最后三種稀釋度,即10-4,10-5和10-6的試管中吸取0.1ml對號放入平板上,用玻棒涂布.
4,培養:高氏I號和查氏倒置培養于28℃培養箱中培養3-5days,牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基在37℃培養1-2days.
5,挑菌落:轉至斜面,檢查是否一致,保存. 
平板劃線(xiàn)法:
1,倒平板,標記培養基名稱(chēng),編號和實(shí)驗日期.
2,劃線(xiàn)方法 
稀釋混合平板法 :
1,先加菌
2,倒平板時(shí)注意培養基溫度
3,混合均勻
微生物培養技術(shù)
1,斜面接種
2,液體培養基接種
3,穿刺接種
4,將已接種的斜面,半固體和液體培養 基放置培養箱中培養
5,將生長(cháng)好的菌種用牛皮紙包好,置4℃冰箱中保存.
實(shí)驗三,菌種保藏
幾種常用的保藏方法:
1,傳代培養法
保藏的菌種通過(guò)斜面,穿刺或皰肉培養基(用于厭氧細菌)培養好后,置4C 冰箱中存放,定期進(jìn)行傳代培養,再存放.
可用膠塞代替棉塞或在斜面上覆蓋一層無(wú)菌液體石蠟來(lái)進(jìn)一步延長(cháng)保存期.
2,載體法
使生長(cháng)合適的微生物吸附在一定的載體上進(jìn)行干燥.
常用的載體有土壤,砂土,硅膠,明膠,麩皮,磁珠和濾紙片等.
3,懸液法
將細菌,酵母菌細胞懸浮在一定的溶液中保存.
溶液包括蒸餾水,糖溶液,磷酸緩沖液,食鹽水等.
4,冷凍法
使菌種始終存放在低溫環(huán)境下的保藏方法.包括低溫法和液氮法.
此法關(guān)鍵是要克服細胞的冷凍損傷.注意控制降溫速率及保護劑的使用.
5,真空干燥法
這類(lèi)方法包括冷凍真空干燥法和L-干燥法.
冷凍真空干燥法是將要保藏的微生物樣品先經(jīng)低溫預凍,然后在低溫狀態(tài)下進(jìn)行減壓干燥.
L-干燥法則不需要低溫預凍樣品,只是使樣品維持在10-20C 范圍內進(jìn)行真空干燥.
操作方法
1,斜面保藏法
將菌種轉接在適宜固體斜面培養基上,待其充分生長(cháng)后,用牛皮紙將棉塞部分包扎好(棉塞換成膠塞效果更好),置4C 冰箱中包藏.
保藏時(shí)間依微生物的種類(lèi)而定.霉菌,放線(xiàn)菌及芽孢菌保存2-4個(gè)月移種一次,酵母菌間隔兩個(gè)月,普通細菌一個(gè)月,假單胞菌兩周傳代一次.
此法優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單,使用方便,缺點(diǎn)是保藏時(shí)間短,易被污染.
2,液體石蠟保藏法
將無(wú)菌石蠟加在已長(cháng)好菌的斜面上,其用量以高出斜面頂端1CM為準,使菌種與空氣隔絕.
將試管直立,置低溫或室溫下保存.
此法實(shí)用且效果較好.霉菌,放線(xiàn)菌,芽孢菌可保藏兩年以上,酵母菌可保藏1-2年,普通細菌也可保藏1年左右.
3,穿刺保藏法
按穿刺接種方式培養菌種,菌種長(cháng)好后用膠塞封嚴,置4℃冰箱存放.
4,砂土管保藏法
(1)河砂處理
取河砂若干加入鹽酸10% ,加熱煮沸30min除去有機機質(zhì).倒去鹽酸溶液,用自來(lái)水沖洗至中性,最后一次用蒸鎦水沖洗,烘干后用40目篩子過(guò)篩,棄去粗顆粒,備用.
(2)土壤處理 
取非耕作層不含腐殖質(zhì)的痩黃土或紅土,加自來(lái)水浸泡洗滌數次,直至中性.烘干后碾碎,用100目篩子過(guò)篩,粗顆粒部分丟掉.
(3)砂土混合 
處理妥當的河砂與土壤按3:1的比例摻合(或根據需要而用其他比例,甚至可全部作砂或土)均勻后,裝入10x100mm的小試管或安瓿管中,每管分裝1g左右,塞上棉塞,進(jìn)行滅菌(通常采用間歇滅菌2--3次),最后烘干.
(4)無(wú)菌檢查 
每10支砂土管隨機抽1支,將砂土倒入肉湯培養基中,30℃培養40h,若發(fā)現有微生物生長(cháng),所有砂土管則需重新滅菌,再作無(wú)菌試驗,直至證明無(wú)菌后方可使 用.
(5)菌懸液的制備 
取生長(cháng)健壯的新鮮斜面菌種,加入2-3ml無(wú)菌水(每18x180mm 的試管斜面菌種),用接種環(huán)輕輕將菌苔洗下,制成菌懸液.
(6)分裝樣品 
每支砂土管(注明標記后)加入0.5ml菌懸液(剛剛使砂土潤濕為宜), 用接種針拌勻.
(7)干燥 
將裝有菌懸液的砂土管放入干燥器內,干燥器底部盛有干燥劑.用真空泵抽干水分后火焰封口(也可用橡皮塞或棉塞塞住試管口).
(8)保存 
置4℃冰箱或室溫干燥處,每隔一定的時(shí)間進(jìn)行檢測.此法多用于產(chǎn)芽孢的細菌,產(chǎn)生孢子的霉菌和放線(xiàn)菌.在抗生素工業(yè)生產(chǎn)中應用廣泛, 效果較好,可保存幾年時(shí)間,但對營(yíng)養細胞效果不佳.
5,冷凍真空干燥法
(1)凍干管的準備:中性硬制玻璃,烘干,滅菌.
(2)菌種培養:細菌芽孢脫落;放,霉孢子豐滿(mǎn).
(3)保護劑的配制:配制,滅菌,檢查
(4)菌懸液的制備:2-3ml保護劑
(5)分裝樣品:菌懸液每管0.2ml
(6)預凍:程序控溫儀降溫
(7)冷凍真空干燥:-50℃下抽真空
(8)取出樣品:輕敲松散即達標
(9)第二次干燥:
(10)熔封
(11)存活性檢測:抽取一管進(jìn)行存活性檢查
(12)保存:4℃保存
實(shí)驗三-1,細菌的形態(tài)和結構觀(guān)察(簡(jiǎn)單染色)
一,目的要求
觀(guān)察細菌的菌落特征
掌握簡(jiǎn)單染色法
在油鏡下觀(guān)察細菌個(gè)體的形態(tài)
學(xué)習環(huán)境中微生物的檢查方法,并加深對微生物分布廣泛性的認識
二,基本原理
形態(tài)觀(guān)察主要包括群體的形態(tài)和個(gè)體的形態(tài)觀(guān)察.
細菌的基本形態(tài)主要分為球菌,桿菌,螺旋菌三大類(lèi),近年還發(fā)現星狀和四方形細菌等.細菌形態(tài)受培養時(shí)間,培養基成分,濃度,培養溫度,培養時(shí)間等發(fā)生變化.
細菌菌落大多表面光滑濕潤,有光澤,一般菌落較小,質(zhì)地顏色均勻,同培養基結合不緊密.菌落特征與組成菌落的細胞結構,生長(cháng)狀況,排列方式,好氣性和運動(dòng)性直接相關(guān).
細菌個(gè)體微小,較透明,必須染色方可呈現.根據細菌個(gè)體形態(tài)觀(guān)察的不同要求,可將染色分為3種類(lèi)型:簡(jiǎn)單染色,鑒別染色,特殊染色.
簡(jiǎn)單染色法原理
細菌在中性的環(huán)境中帶負電荷,用堿性染料(解離時(shí)帶正電荷)如美蘭,結晶紫等進(jìn)行染色.
實(shí)驗三-2:放線(xiàn)菌的形態(tài)結構觀(guān)察
一,目的要求
掌握放線(xiàn)菌形態(tài)結構觀(guān)察的方法
觀(guān)察放線(xiàn)菌的菌落特征,個(gè)體形態(tài)及其繁殖方式.
二,原理
放線(xiàn)菌菌落在培養基上著(zhù)生牢固,與基質(zhì)結合緊密,難以用接種針挑取.
放線(xiàn)菌細胞一般呈分枝無(wú)隔的絲狀,菌絲體分為在培養基內部的基內菌絲和伸出培養基表面的氣生菌絲.氣生菌絲上部分化成孢子絲,呈螺旋狀,波浪狀或分枝狀.菌絲呈各種顏色,有的能分泌水溶性色素到培養基內.孢子絲長(cháng)出孢子,孢子形狀各異.由于孢子的存在使菌落表面呈干粉狀.
三,實(shí)驗內容
(一)菌落形態(tài)觀(guān)察及菌苔特征的觀(guān)察
觀(guān)察放線(xiàn)菌菌落表面形狀,大小,顏色,邊緣以及有無(wú)色素分泌;并用接種環(huán)挑取菌落,注意在培養基上的著(zhù)生的緊密情況.區別基內菌絲,氣生菌絲及孢子絲的著(zhù)生部位.
(二)個(gè)體形態(tài)特征觀(guān)察
可直接觀(guān)察,也可置于載片上觀(guān)察.注意放線(xiàn)菌菌絲直徑的大小,孢子絲的形狀.
(三)孢子形態(tài)觀(guān)察
用印片法
(四)用插片法觀(guān)察放線(xiàn)菌形態(tài)
實(shí)驗三-3:霉菌的形態(tài)觀(guān)察
一,目的要求
觀(guān)察霉菌菌落特征
掌握霉菌的制片方法
觀(guān)察霉菌個(gè)體形態(tài)及各種無(wú)性孢子及有性孢子的形態(tài)
二,基本原理
霉菌是由交織在一起的菌絲體構成.菌絲呈管狀,有的有橫隔將菌絲分割為多細胞(如青霉,曲霉),有的菌絲沒(méi)有橫隔(如毛霉,根霉).菌絲直徑比一般細菌和放線(xiàn)菌菌絲大幾倍到幾十倍.菌落形態(tài)較大,質(zhì)地疏松,顏色各異,有絲狀,絨毛狀或蜘蛛網(wǎng)狀的菌絲體.
將菌絲體放在水中易變形,將其置于乳酸石炭酸溶液中,保持菌絲體原形.
實(shí)驗四,細菌的形態(tài)結構觀(guān)察(革蘭氏染色,芽孢染色, 莢膜染色) 
革蘭氏染色法原理
由于細菌細胞壁結構的不同可將其分為革蘭氏陰性和陽(yáng)性
芽孢染色原理
芽孢壁比營(yíng)養細胞的細胞壁結構復雜而且致密,透性低,著(zhù)色和脫色較營(yíng)養細胞難.采用堿性染料并在微火上加熱,或延長(cháng)染色時(shí)間,使菌體和芽孢同時(shí)染色后,用蒸餾水沖洗,脫去菌體顏色,保留芽孢的顏色.并用另一種對比鮮明的染料 使菌體著(zhù)色.
莢膜染色原理
負染法,使背景與菌體之間形成一透明區.因莢膜薄,且易變形,所以不能用加熱法固定.

 

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