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一、簡(jiǎn)介
單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）簡(jiǎn)稱(chēng)單增李斯特氏菌，是一種人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表現為敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多。它廣泛存在于自然界中，食品中存在的單增李氏菌對人類(lèi)的安全具有危險，該菌在4℃的環(huán)境中仍可生長(cháng)繁殖，是冷藏食品威脅人類(lèi)健康的主要病原菌之一，因此，在食品衛生微生物檢驗中，必須加以重視。
二、參考標準
《GB 4789.30-2016 食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》。
三、檢驗方法以及結果
單核細胞增生李斯特氏菌定性檢驗程序見(jiàn)圖1。
圖1 單核細胞增生李斯特氏菌定性檢驗程序
1.分離
將樣品進(jìn)行梯度稀釋后，選擇合適的稀釋度涂布李斯特氏菌顯色平板和PALCAM瓊脂平板，于36℃±1℃培養24h～48h。
單增李斯特氏菌的典型菌落在PALCAM瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落，周?chē)凶睾谏馊�，有些菌落有黑色凹陷。在李斯特氏菌顯色平板上為藍色菌落，菌落周?chē)幸徊煌该鳝h(huán)。如圖2所示：
A：PALCAM瓊脂平板；B：李斯特氏菌顯色平板
圖2 單增李斯特氏菌在PALCAM瓊脂平板和李斯特氏菌顯色平板典型菌落特征
2.染色鏡檢
挑取純培養的單個(gè)可疑菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，單增李斯特氏菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，鏡檢為紫色短桿狀。如圖3所示：
圖3 單增李斯特氏菌革蘭氏染色鏡檢結果
3.動(dòng)力試驗
挑取純培養的單個(gè)可疑菌落穿刺SIM動(dòng)力培養基，于25℃～30℃培養48h。單增李斯特氏菌有動(dòng)力，在SIM培養基上方呈傘狀生長(cháng)。如圖四所示：
圖4 單增李斯特氏菌SIM動(dòng)力試驗結果
4.過(guò)氧化酶試驗
挑取純培養的單個(gè)可疑菌落，滴加3%過(guò)氧化氫酶試劑后，單增李斯特氏菌菌落在30s內產(chǎn)生大量氣泡。如圖5所示：
圖5 單增李斯特氏菌過(guò)氧化氫酶試驗結果
5.生化鑒定
選擇過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性反應的菌落，繼續使用海博單增李斯特氏菌的生化鑒定條進(jìn)行生化鑒定，單增李斯特氏菌生化反應結果為木糖陰性、鼠李糖陽(yáng)性、葡萄糖陽(yáng)性、麥芽糖陽(yáng)性、甘露醇陰性、七葉苷陽(yáng)性、MR-VP陽(yáng)性。如圖6所示：
圖6 單增李斯特氏菌生化鑒定條試驗結果
注意事項：MR試驗需在培養結束后滴加甲基紅試劑1滴，立即觀(guān)察結果，出現紅色為陽(yáng)性反應；VP試驗需在培養結束后滴加VP試劑（甲液0.3mL，乙液0.1mL），混勻后觀(guān)察結果（4小時(shí)內），出現紅色為陽(yáng)性反應。
6.溶血試驗
將新鮮的羊血瓊脂平板底面劃分為20～25個(gè)小格，挑取純培養的單個(gè)可疑菌落刺種到血平板上，每格刺種一個(gè)菌落，并刺種陽(yáng)性對照菌（單增李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌）和陰性對照菌（英諾克李斯特氏菌），穿刺時(shí)盡量接近底部，但不要觸到底面，同時(shí)避免瓊脂破裂。36℃±1℃培養24h～48h，于明亮處觀(guān)察。
單增李斯特氏菌呈現狹窄、清晰、明亮的溶血圈，英諾克李斯特氏菌無(wú)溶血圈，伊氏李斯特氏菌產(chǎn)生寬的、輪廓清晰的β-溶血區域。如圖7所示：
A-1、A-2、A-3和A-4均為待測菌落；B：?jiǎn)卧隼钏固厥暇?yáng)性對照；
C：伊氏李斯特氏菌；D：英諾克李斯特氏菌
圖7 單增李斯特氏菌溶血試驗結果
7.協(xié)同溶血試驗
在羊血瓊脂平板上平行劃線(xiàn)接種金黃色葡萄球菌和馬紅球菌，挑取純培養的單個(gè)可疑菌落垂直劃線(xiàn)接種于平行線(xiàn)之間，垂直線(xiàn)兩端不要觸及平行線(xiàn)，距離1mm～2mm，同時(shí)接種單增李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌，于36±1℃培養24h～48h。
單增李斯特氏菌在靠近金黃色葡萄球菌處出現約2mm的β-溶血增強區域，伊氏李斯特氏菌在靠近馬紅球菌處出現約5～10mm的“箭頭狀”β-溶血增強區域，英諾克李斯特氏菌不產(chǎn)生溶血現象。如圖8所示：
A：金黃色葡萄球菌；B：馬紅球菌；C：?jiǎn)卧隼钏固厥暇?yáng)性對照
D和G：待測菌；E：英諾克李斯特氏菌；F：伊氏李斯特氏菌
圖8 單增李斯特氏菌協(xié)同溶血試驗結果
三、結果判定
若待測菌在PALCAM瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落，周?chē)凶睾谏馊�，有些菌落有黑色凹陷；在李斯特氏菌顯色平板上為藍色菌落，菌落周?chē)幸徊煌该鳝h(huán)；鏡檢結果為革蘭氏陽(yáng)性桿菌；有動(dòng)力、過(guò)氧化酶陽(yáng)性、木糖陰性、鼠李糖陽(yáng)性、葡萄糖陽(yáng)性、麥芽糖陽(yáng)性、甘露醇陰性、七葉苷陽(yáng)性、MR-VP陽(yáng)性，可初步判斷為單增李斯特氏菌。
注：本文屬海博生物原創(chuàng )，未經(jīng)允許不得轉載。
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