糞大腸菌群計數標準解析

一、參考標準

  根據《GB4789.39-2013 糞大腸菌群標準計數》中定義，糞大腸菌群是一群在44.5℃中培養24—48小時(shí)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。

二、檢驗流程

  1、樣本稀釋

  固體和半固體樣品：稱(chēng)取25g樣品，置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內，制成1:10的樣品勻液。

  液體樣品：以無(wú)菌吸管吸取樣品25mL置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jì)阮A置適當數量的無(wú)菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10 的樣品勻液。

  注意事項：樣品勻液的pH值應在6.5～7.5之間，必要時(shí)分別用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl調節；根據對樣品污染狀況的估計，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無(wú)菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過(guò)程不得超過(guò)15 min。

  2、初發(fā)酵試驗

  每個(gè)樣品，選擇3個(gè)適宜的連續稀釋度的樣品勻液，每個(gè)稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL，36℃±1℃培養24h±2h，觀(guān)察倒管內是否有氣泡產(chǎn)生，24h產(chǎn)氣者進(jìn)行復發(fā)酵試驗，如未產(chǎn)氣則繼續培養至48h±2h。

  根據標準菌株對月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯培養基進(jìn)行驗證，結果如圖一：

a:大腸埃希氏菌ATCC25922，b:陰溝腸桿菌ATCC23355，c:弗氏檸檬酸鹽桿菌ATCC43864

d:糞腸球菌ATCC29212，e:空白對照

圖一 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯微生物質(zhì)控結果

  注意事項：液體樣品可以選擇原液；若是接種量需要超過(guò)1mL，則用雙料LST肉湯。

  3、復發(fā)酵試驗

  用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養物1環(huán)，移種于預先升溫至44.5℃的EC肉湯管中。將所有接種的EC肉湯管放入44.5℃±0.2℃培養箱內，培養24h±2h，記錄EC肉湯管的產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣管為糞大腸菌群陽(yáng)性，不產(chǎn)氣為糞大腸菌群陰性。

  根據標準菌株對EC肉湯培養基進(jìn)行驗證，結果如圖二：

a:大腸埃希氏菌ATCC25922，b:產(chǎn)氣腸桿菌ATCC35029，c:大腸埃希氏菌CMCC44102

d:弗氏檸檬酸桿菌ATCC43864 e：糞腸球菌ATCC29212，f:金黃色葡萄球菌ATCC25923 g：空白對照

圖二 EC肉湯微生物質(zhì)控結果

  注意事項：定期以已知為44.5℃產(chǎn)氣陽(yáng)性的大腸埃希氏菌和44.5℃不產(chǎn)氣的產(chǎn)氣腸桿菌或其他大腸菌群細菌作陽(yáng)性和陰性對照。

三、結果判定

  根據證實(shí)為糞大腸菌群的陽(yáng)性管數，查糞大腸菌群最可能數（MPN）檢索表，報告每g (mL)糞大腸菌群的MPN值。

  在10^-1～10^-5五個(gè)連續稀釋度中確定最適的三個(gè)連續稀釋度方法如下：

  a）有一個(gè)以上的稀釋度3管均為陽(yáng)性。選擇三管都是陽(yáng)性結果的最高稀釋度及其相連的兩個(gè)更高稀釋度（見(jiàn)表B.1示例a、b，表中帶下劃線(xiàn)的數字對應的接種樣品量為最終選取的最適稀釋度，下同）；

  b）在未選擇的較高稀釋度中還有陽(yáng)性結果時(shí)，則順次下移到下一個(gè)更高三個(gè)連續稀釋度（見(jiàn)表B.1示例c）；

  如果中間有某個(gè)稀釋度沒(méi)有陽(yáng)性結果，但更高稀釋度有陽(yáng)性結果，則將此陽(yáng)性結果加到前一稀釋度，進(jìn)而確定三個(gè)連續稀釋度（見(jiàn)表B.1示例d）；

  如果不能按照這個(gè)原則找到三個(gè)合適的稀釋度，則選擇前一個(gè)較低的稀釋度（見(jiàn)表B.1示例e）；

  c）沒(méi)有任何一個(gè)稀釋度3管均為陽(yáng)性。如果沒(méi)有一個(gè)稀釋度的3管均為陽(yáng)性，則選擇三個(gè)最低稀釋度（見(jiàn)表B.1示例f）；

  如果在更高的沒(méi)有被選擇的稀釋度還有陽(yáng)性結果，將此陽(yáng)性結果加到選擇的最高稀釋度，進(jìn)而確定三個(gè)連續稀釋度（見(jiàn)表B.1示例g）。

  每g(mL)檢樣中糞大腸菌群最可能數（MPN）的檢索見(jiàn)表C.1

  舉例說(shuō)明：若糞大腸菌群的陽(yáng)性管數的示例為3-3-2-0-1，則選擇的稀釋度為3-2-1，根據MPN檢索表所得MPN數值為1500。

  注意事項：MPN檢索表采用3個(gè)稀釋度[0.1g(mL)、0.01g(mL)和0.001g(mL)]、每個(gè)稀釋度接種3管。并且表內所列檢樣量如改用lg（mL）、0.1g(mL)和0.01g(mL)時(shí)，表內數字應相應降低10倍；如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)、0.0001g(mL)時(shí)，則表內數字應相應增高10倍，其余類(lèi)推。

  注：本文屬海博生物原創(chuàng )，未經(jīng)允許不得轉載。

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