有關(guān)BS瓊脂平板上產(chǎn)生黑渣問(wèn)題的探討

一、背景簡(jiǎn)介

  沙門(mén)氏菌很容易引起中毒，人一旦攝入含有大量沙門(mén)氏菌的動(dòng)物性產(chǎn)品，就會(huì )引起細菌性感染，進(jìn)而在毒素作用下發(fā)生食物中毒。肉、蛋以及食品從加工到出售的過(guò)程中都十分容易發(fā)生沙門(mén)氏菌的傳播污染， 禽沙門(mén)氏菌可以引起禽白痢、傷寒、副傷寒等疾病, 并污染食物, 造成人類(lèi)食物中毒。因此對沙門(mén)氏菌檢測事關(guān)重大。

  亞硫酸鉍瓊脂培養基，簡(jiǎn)稱(chēng)BS瓊脂，主要用于沙門(mén)氏菌的檢測。在《GB4789.4-2016 食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 沙門(mén)氏菌檢驗》中，這是一款必須用到的培養基。

  沙門(mén)氏菌檢驗程序見(jiàn)圖一。

圖一

  關(guān)于BS瓊脂，具體可參考文章：亞硫酸鉍瓊脂（BS）原理和使用方法 。

二、面臨的問(wèn)題

  在實(shí)際配制使用過(guò)程中，經(jīng)常會(huì )有實(shí)驗人員反饋，這種培養基制成的平板底部有黑渣，并且盛放培養基的搪瓷缸底部也會(huì )有很多黑渣沉淀，有的人甚至懷疑是培養基原料沒(méi)有溶解或者培養基本身有雜質(zhì)所致。本文主要就這一問(wèn)題做一探討。

三、原因探究

  首先，來(lái)看該培養基的配方，成分(g/L)。

  檸檬酸鉍銨在水熱過(guò)程中能分解出NH₄⁺，檸檬酸根在水熱過(guò)程中分解產(chǎn)生CO₃^2-，部分Bi³⁺被還原成Bi單質(zhì)；金屬Bi呈粉紅色；硫酸亞鐵中的Fe²⁺也可能形成Fe³⁺等形式。這些離子之間相互反應，不可避免地產(chǎn)生了一些帶顏色的沉淀物。

四、問(wèn)題解決

  下面再來(lái)看一下，GB4789.4-2016中對該培養基配制方法的敘述：

  將前三種成分加入300mL蒸餾水(制作基礎液)，硫酸亞鐵和磷酸氫二鈉分別加入20mL和30mL蒸餾水中，檸檬酸鉍銨和亞硫酸鈉分別加入另一20mL和30mL蒸餾水中，瓊脂加入600mL蒸餾水中。然后分別攪拌均勻,煮沸溶解。冷至80℃左右時(shí)，先將硫酸亞鐵和磷酸氫二鈉混勻，倒入基礎液中，混勻。

  將檸檬酸鉍銨和亞硫酸鈉混勻，倒入基礎液中，再混勻。調節pH至7.5±0.2，隨即傾入瓊脂液中，混合均勻，冷至50℃～55℃。加入煌綠溶液，充分混勻后立即傾注平皿。

  標準中，之所以將不同的成分分組溶解，按照一定的條件和順序混合，就是為了避免或減少這些成分之間相互反應，形成不溶物。實(shí)際使用過(guò)程中，為了使用的方便，通常將培養基成分進(jìn)行混合，形成干粉混合物，再根據需要制成平板使用。這就不可避免地會(huì )使傾注的平板上自帶黑渣。那么這些黑渣的存在對實(shí)驗效果有沒(méi)有影響？又怎樣能將這種影響盡量降低呢？下面我們來(lái)看一組實(shí)驗：

  首先，在室溫條件下，按比例配制200mlBS培養基，充分攪拌，使里面的成分溶解完全，然后按照常規方法加熱煮沸滅菌，加熱過(guò)程中不斷攪拌，避免粘底糊化，冷卻至50℃-55℃，不再做任何攪拌，直接依次傾入10個(gè)平皿并編號。傾倒時(shí)會(huì )發(fā)現，開(kāi)始的幾個(gè)平板黑渣較少，越往底部，黑渣越多，最后再搪瓷缸底部會(huì )沉淀下大量的黑色不溶物。如圖二：

圖二

  傾倒出的平板上有明顯黑渣，如圖三：

圖三

  將沙門(mén)氏菌在制好的平板上進(jìn)行劃線(xiàn)、培養，會(huì )發(fā)現，開(kāi)始傾倒的幾個(gè)平板上，3區都能長(cháng)出，且菌落直徑較大，而最后傾注的平板上，沙門(mén)氏菌的生長(cháng)明顯受到影響，且菌落直徑偏小。如圖四：

圖四

  作為對比試驗，傾倒的過(guò)程中，不斷攪拌，傾注成的平板就會(huì )比較均勻，搪瓷缸底物幾乎沒(méi)有黑渣沉淀下來(lái)，其實(shí)這個(gè)道理很簡(jiǎn)單，就是在攪拌的過(guò)程中，將原本形成的黑色不溶物均勻地分散到所有平皿中去了。倒出的平皿如圖五：

圖五

  沙門(mén)氏菌在這一組平板上的生長(cháng)特征基本一致，沒(méi)有明顯差別。如圖六：

圖六

  通過(guò)上面的試驗，我們可以看到，只要在傾倒平板的過(guò)程中持續進(jìn)行攪拌，傾倒完畢，搪瓷缸底部就不會(huì )有很多黑渣，并且倒出的平板沒(méi)有黑渣聚集的現象。沙門(mén)氏菌的生長(cháng)也比較均一。對菌落的影響不明顯。不影響培養基的使用。

  在使用過(guò)程中，只要把握“均勻攪拌”這一原則，就可以很好地使用這款培養基，而不能一味糾結于平板上的黑渣。因為這是不可避免的。

五、注意事項

  GB4789.4中特別指出，本培養基不需要高壓滅菌,在制備過(guò)程中不宜過(guò)分加熱,避免降低其選擇性,貯于室溫暗處,超過(guò)48h會(huì )降低其選擇性,本培養基宜于當天制備,第二天使用。

  對此，分別用放置24h和當天配制的BS平板進(jìn)行劃線(xiàn)試驗對比，結果如圖七：

圖七

  從圖中可以看出，放置24h后使用，劃線(xiàn)菌落明顯比當天配制當天使用長(cháng)得好一些，現配現用，由于抑制性太強，容易導致有些目標菌生長(cháng)不出來(lái)，造成漏檢。

  有關(guān)目標菌的生長(cháng)對比，還可以參考：亞硫酸鉍瓊脂配置后不同使用時(shí)間目標菌的生長(cháng)對比。

六、參考文獻

  [1] GB 4789.4-2016 食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 沙門(mén)氏菌檢驗。

  [2] 高廣堯，開(kāi)麗紅 禽沙門(mén)氏菌的危害及控制。

  [3] 董興安，雄偉，遇麗  N 摻雜Bi2O2CO3/氧化石墨烯分級結構的合成及其可見(jiàn)光催化性能研究。

  注：本文屬海博生物原創(chuàng )，未經(jīng)允許不得轉載。

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