唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（椰毒假單胞菌酵米面亞種）檢驗

一、參考標準：

  《GB4789.29-2020食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（椰毒假單胞菌酵米面亞種）檢驗》。

二、菌種特征：

  1、生物學(xué)特性：

  革蘭氏陰性桿菌，長(cháng)2.5-3μm，寬0.5-1.0μm，呈桿狀、球桿狀或稍彎曲，兩端鈍圓，無(wú)芽胞，有鞭毛。本菌為兼性厭氧，但易在表面生長(cháng)。最適生長(cháng)溫度為37℃，最適產(chǎn)毒溫度為26℃。pH 5-7范圍內生長(cháng)較好。

  2、流行病學(xué)特點(diǎn)：

  椰毒假單胞菌酵米面亞種（Psedomonas cocovenenans subsp.farino fermentans)是我國發(fā)現的一種食物中毒菌，為唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（Burkholderia gladioli）的一個(gè)病原型。它存在于發(fā)酵的玉米、糯玉米、黃米、高梁米、變質(zhì)銀耳以及周?chē)�環(huán)境中，它是酵米面及變質(zhì)銀耳中毒的病原菌。該菌產(chǎn)生的毒素米酵菌酸是其致病原因。該食物中毒的主要癥狀，開(kāi)始患者感到上腹部不適，少數出現腹瀉、惡心、嘔吐，嘔吐物多為咖啡色，嚴重者出現黃疸、昏迷、四肢抽搐、少尿、血尿、便血和尿潴留，呈現休克而死亡。目前尚無(wú)特效的治療辦法。

三、培養基原理分析及結果：

  1、改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂（mPDA）（點(diǎn)擊此查看培養基詳情）

  原理：馬鈴薯為微生物的生長(cháng)提供各類(lèi)氮源、碳源、維生素，葡萄糖提供能源，瓊脂是培養基的凝固劑，氯霉素可抑制細菌的生長(cháng)，龍膽紫抑制真菌的生長(cháng)。

  結果：培養24 h后，菌落1 mm-2 mm，紫色，光滑、濕潤、邊緣整齊；培養48h后，部分菌落中心可有呈草帽狀凸起。如圖一。

圖一 唐菖蒲伯克霍爾德氏菌ATCC10248培養48h

  2、PCFA培養基（點(diǎn)此查看培養基詳情）

  原理：PCFA培養基基礎中的氯化銨為微生物的生長(cháng)提供氮源；磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉是緩沖劑；氯化鈉可維持細胞滲透壓；氯化鈣、硫酸鎂和硫酸亞鐵為微生物生長(cháng)提供微量元素；葡萄糖和胱氨酸用于唐菖蒲伯克霍爾德氏菌代謝酶的合成；衛矛醇可為微生物生長(cháng)提供碳源；瓊脂是培養基凝固劑。配套添加劑可抑制大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌等革蘭氏陰性桿菌生長(cháng)，同時(shí)也可抑制大部分革蘭氏陽(yáng)性球菌的生長(cháng)。

  結果：培養24 h后，菌落0.5 mm-1 mm，灰白色，光滑、濕潤、邊緣整齊。如圖二。

圖二 唐菖蒲伯克霍爾德氏菌ATCC10248培養48h

  3、卵黃瓊脂

  原理：蛋白胨和牛肉粉提供碳氮源、維生素和生長(cháng)因子；葡萄糖提供能源；氯化鈉維持均衡的滲透壓；瓊脂是培養基的凝固劑；具有卵磷脂酶的細菌可分解卵磷脂生成不溶性甘油酯，從而形成乳白色的混濁帶。

  結果：培養24 h后，菌落2 mm-3 mm，表面光滑、濕潤；培養48 h后，菌落周?chē)�形成乳白色混濁環(huán)，斜射光下可見(jiàn)菌落及周?chē)�培養基表面呈虹彩現象。如圖三。

圖三 唐菖蒲伯克霍爾德氏菌ATCC10248培養48h

四、生化鑒定原理及結果分析：

  1、革蘭氏染色

  試驗所用試劑：革蘭氏染色液試劑盒。

  原理：革蘭氏陽(yáng)性菌由于其細胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時(shí)，因失水反而使網(wǎng)孔縮小，再加上它不含類(lèi)脂，故乙醇處理不會(huì )出現縫隙，因此，能把結晶紫與碘復合物牢牢留在壁內，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、外膜層類(lèi)脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類(lèi)脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結晶紫與碘復合物的溶出，因此通過(guò)乙醇脫色后仍呈無(wú)色，再經(jīng)沙黃等紅色染料復染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。

  結果：革蘭氏陰性，菌體呈短桿狀，單個(gè)或成對排列。如圖四所示。

圖四

  2、氧化酶試驗

  試驗所用試劑：氧化酶試紙。

  原理：氧化酶即細胞色素氧化酶，為細胞色素呼吸酶系統的終末呼吸酶，氧化酶先使細胞色素C氧化，然后此氧化型細胞色素C再使對苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應。在 30s內變?yōu)樗{色或藍紫色為強陽(yáng)性，2min內不變色為陰性。

  結果：不變色，為陰性。如圖五

圖五 左：唐菖蒲伯克霍爾德氏菌ATCC10248  右：銅綠假單胞菌ATCC9027

  3、尿素酶試驗

  試驗所用試劑：尿素酶生化管。

  原理：有些細菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生氨，使培養基變堿呈粉紅色。

  結果：培養基變?yōu)榉奂t色，為陽(yáng)性。如圖六。

左：唐菖蒲伯克霍爾德氏菌ATCC10248  右：大腸埃希氏菌ATCC25922

圖六

  4、檸檬酸鹽利用試驗

  試驗所用培養基：西蒙氏枸櫞酸鹽培養基。

  原理：西蒙氏枸櫞酸鹽培養基中氯化鈉維持均衡的滲透壓，鎂離子是各種代謝中的輔因子，磷酸二氫銨提供氮源，磷酸氫二鉀是緩沖劑，檸檬酸鈉作為碳源，瓊脂是培養基的凝固劑，溴麝香草酚蘭為pH 指示劑。當細菌可以利用銨鹽作為唯一的氮源，同時(shí)利用檸檬酸鹽作為唯一的碳源時(shí)，可在檸檬酸鹽培養基上生長(cháng)，分解檸檬酸鈉，生成碳酸鈉，使培養基產(chǎn)堿變藍色。

  結果：培養基變藍，為陽(yáng)性。如圖七。

左：大腸埃希氏菌ATCC25922  右：唐菖蒲伯克霍爾德氏菌ATCC10248

圖七

  5、石蕊牛奶試驗

  試驗所用培養基：石蕊牛奶培養基。

  原理：牛奶中含有乳糖以及三種主要的蛋白質(zhì)，即酪蛋白、乳清蛋白和乳球蛋白。在石蕊牛奶培養基中，微生物可能表現出一種或幾種代謝特性，每一種特性專(zhuān)屬于特定 菌種，可以輔助細菌的鑒定。這些代謝特性包括乳糖發(fā)酵、石蕊還原、凝乳產(chǎn)生、胨化（蛋白消化）和產(chǎn)氣。石蕊是良好的酸堿指示劑，自身的氧化還原特性及對細菌的低毒性（相對于溴甲酚紫）使得石蕊成分十分有用的牛奶培養基指示劑。

  結果：頂部淡紫色，底部乳白色。如圖八。

左：空白對照  右：唐菖蒲伯克霍爾德氏菌ATCC10248

圖八

  6、靛基質(zhì)試驗

  試驗所用培養基、試劑：蛋白胨水（色氨酸肉湯）、Kovacs靛基質(zhì)試劑。

  原理：蛋白胨為微生物的生長(cháng)提供碳氮源、維生素和生長(cháng)因子；氯化鈉維持均衡的滲透壓；含有色氨酸酶的細菌，能分解蛋白胨中的色氨酸，形成靛基質(zhì)（吲哚），靛基質(zhì)無(wú)色，當加入對氨基苯甲酸試劑后，形成可見(jiàn)的紅紫色醌式化合物，即玫瑰靛基質(zhì)。

  結果：滴加Kovacs靛基質(zhì)試劑后產(chǎn)生黃色環(huán)，為陰性。如圖九

左：唐菖蒲伯克霍爾德氏菌ATCC10248  右：大腸埃希氏菌ATCC25922

圖九

  注：唐菖蒲伯克霍爾德氏菌其它生化特征見(jiàn)下表。

  注：本文屬海博生物原創(chuàng )，未經(jīng)允許不得轉載。

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