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一、檢驗標準
《GB4789.13-2012 食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗》
二、檢驗過(guò)程解析及注意事項
1.樣品制備
無(wú)菌稱(chēng)取25g樣品加入至含225mL0.1%蛋白胨水的均質(zhì)袋中，均質(zhì)1-2min，將制備好的樣品液用含9mL0.1%蛋白胨水試管進(jìn)行十倍系列稀釋樣液；
注意事項：產(chǎn)氣莢膜梭菌為厭氧菌，暴露在空氣中易死亡，因此從稱(chēng)樣、制備樣液、稀釋、到傾注培養基進(jìn)行培養整個(gè)過(guò)程要快速完成，如不能及時(shí)完成，可按標準要求置于2-5℃保存（數小時(shí)內）或加入緩沖-甘油氯化鈉溶液置于-60℃冷凍保存。
2.分離計數
吸取制備好的樣液加入至無(wú)菌空平皿中，加入約15mL的TSC培養基（冷卻至50℃左右），混合均勻；待培養基凝固后，在上方覆蓋約10mL的TSC培養基，凝固后置于厭氧環(huán)境內36±1℃培養20-24h；培養結束后，計數黑色菌落；
注意事項：
（1）注意傾注時(shí)的培養基溫度和時(shí)間，培養基溫度過(guò)高或操作時(shí)間過(guò)長(cháng)都有可能導致產(chǎn)氣莢膜梭菌死亡；
（2）覆蓋培養基可防止菌落蔓延，并使產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落呈黑色（PS：部分產(chǎn)氣莢膜梭菌若生長(cháng)在培養基表面時(shí)會(huì )因產(chǎn)生的硫化氫逃逸，菌落呈現無(wú)色，導致漏檢，覆蓋培養基則可以留住硫化氫與培養基中的鐵鹽反應生成黑色的FeS，使菌落呈現黑色，因此必須要進(jìn)行覆蓋操作）。
3.分離純化培養
用接種針（環(huán)）從TSC平板上挑取黑色菌落，接種至液體硫乙醇酸鹽培養基中，36±1℃培養18-24h；
注意事項：液體硫乙醇酸鹽培養基自身可形成厭氧環(huán)境，無(wú)需覆蓋石蠟或置于厭氧環(huán)境培養（不可振蕩培養，液體流動(dòng)會(huì )破壞下層的厭氧環(huán)境），接種前注意氧化層的高度（可在臨用前水浴加熱驅氧），接種時(shí)需至氧化層以下，產(chǎn)氣莢膜梭菌可在氧化層以下呈顆�；驐l狀生長(cháng)，有時(shí)可見(jiàn)產(chǎn)氣，在培養基表面生成大量氣泡。詳情請參考：液體硫乙醇酸鹽培養基原理及注意事項
4.產(chǎn)氣莢膜梭菌鑒定
鑒定試驗：純化后的可疑菌做革蘭氏染色，并做暴烈發(fā)酵試驗、乳糖-明膠試驗和動(dòng)力-硝酸鹽試驗。典型的產(chǎn)氣莢膜梭菌為革蘭氏陽(yáng)性粗短的桿菌，有時(shí)可見(jiàn)芽孢，暴烈發(fā)酵試驗陽(yáng)性，乳糖陽(yáng)性，明膠陽(yáng)性，硝酸鹽還原陽(yáng)性，動(dòng)力陰性。
暴烈發(fā)酵試驗：圖1中a，b為產(chǎn)氣莢膜梭菌暴烈發(fā)酵試驗結果，c為陰性對照，d為空白管。接種時(shí)使用移液管或移液槍吸取1mL的FTG培養物伸入至含鐵牛奶試管中培養基液面下方，緩慢加入菌液，更易觀(guān)察到明顯的暴烈發(fā)酵現象。
圖1暴烈發(fā)酵試驗現象
乳糖-明膠試驗：產(chǎn)氣莢膜梭菌可發(fā)酵乳糖，使培養基變黃，并液化明膠，使培養基呈液態(tài)不凝固。
注意事項：
（1）產(chǎn)氣莢膜梭菌為厭氧菌，此生化反應需大量接種更易看到試驗結果，實(shí)際操作時(shí)若用接種針挑取FTG培養物直接接種需氧培養，可能會(huì )遇到由于接種量不足和需氧培養導致菌不生長(cháng)的情況，可以采用吸取0.1mL的FTG培養物或挑取平板上的大量菌苔接種方式后厭氧培養，更易觀(guān)察到試驗結果；
（2）明膠的凝固點(diǎn)在30℃左右，因此在36℃培養結束時(shí)，明膠是呈液態(tài)的，所以必須要放入低溫環(huán)境使培養基冷卻，再觀(guān)察培養基是否呈液態(tài)狀；
（3）不同細菌液化明膠能力有差別，增菌接種量可以更快觀(guān)察到明膠液化現象，因此遇到明膠不液化問(wèn)題時(shí)，可以嘗試增大接種量或延長(cháng)培養時(shí)間再觀(guān)察試驗結果。
圖2產(chǎn)氣莢膜梭菌的乳糖-明膠試驗現象
動(dòng)力-硝酸鹽試驗：產(chǎn)氣莢膜梭菌無(wú)動(dòng)力，在培養基中沿穿刺線(xiàn)生長(cháng)；硝酸鹽還原陽(yáng)性，加入硝酸鹽還原試劑后變紅。
注意事項：
（1）同乳糖-明膠試驗，用接種針挑取FTG培養物穿刺接種需氧培養可能觀(guān)察不到菌生長(cháng)，可采用接種針挑取菌苔穿刺接種方式進(jìn)行培養，再觀(guān)察結果；
（2）觀(guān)察硝酸鹽還原試驗時(shí)，若滴加試劑后不變紅，原因有2：①由于細菌不還原硝酸鹽（-），②細菌將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，又繼續將亞硝酸鹽還原為氮氣、氨、氮氧化物等（+）；因此當出現滴加試劑不變紅時(shí)，需要補加鋅粉或鋅粒，檢測培養基中的硝酸鹽是否存在。鋅可以將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，加入鋅之后若出現緩慢變紅現象，說(shuō)明培養基中有硝酸鹽存在，未被細菌還原，可判為硝酸鹽還原陰性；加入鋅之后若沒(méi)有顏色變化，說(shuō)明培養基中的硝酸鹽已全部被細菌還原，也可判為硝酸鹽還原陽(yáng)性。
圖3產(chǎn)氣莢膜所的動(dòng)力-硝酸鹽試驗現象
三、試驗結果說(shuō)明及其他鑒定試驗
檢驗結果在TSC上呈黑色菌落，革蘭氏染色為陽(yáng)性短桿菌，生化鑒定符合暴烈發(fā)酵（+），乳糖（+），明膠（+），動(dòng)力（-），硝酸鹽還原（+），即可判為產(chǎn)氣莢膜梭菌。
在《GB8538-2016 食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》標準中，對產(chǎn)氣莢膜梭菌鑒定有一項卵黃試驗，產(chǎn)氣莢膜梭菌會(huì )產(chǎn)生卵磷脂酶，分解卵黃中的卵磷脂，在菌落周?chē)纬沙恋憝h(huán)，該特征反應也可做為產(chǎn)氣莢膜梭菌的鑒定補充試驗。
a:金葡菌ATCC6538乳白色菌落無(wú)渾濁帶
b:產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124乳白至淡黃色菌落有較大渾濁帶
圖4產(chǎn)氣莢膜梭菌卵黃試驗現象
注：本文屬海博生物原創(chuàng )，未經(jīng)允許不得轉載。
