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在進(jìn)行培養基的驗收，檢驗培養基的靈敏度、生長(cháng)率時(shí)，都需要用到定量菌株。細菌的個(gè)體很小，肉眼無(wú)法直接看到，我們所看到的培養基平板上的菌落、渾濁的液體培養基，都是數以?xún)|計的細菌集合體。在初次進(jìn)行低濃度定量菌株菌懸液（10-100CFU/mL或20-200CFU/mL）制作時(shí)，通常使用十倍或百倍稀釋法進(jìn)行制作。
下面就為大家介紹十倍稀釋法的具體操作步驟：
1、將生理鹽水（或磷酸鹽緩沖液等）分裝至試管中，每支裝量為9mL（百倍稀釋可用10mL，特殊情況也可使用9mL做近似百倍稀釋?zhuān)�，進(jìn)行滅菌處理（121℃滅菌15-30min即可）；
注：在進(jìn)行厭氧菌（如生孢梭菌，產(chǎn)氣莢膜梭菌）稀釋時(shí)，選用0.1%蛋白胨水或pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液做為稀釋劑效果更佳；若不在厭氧環(huán)境中操作，從開(kāi)始稀釋至使用菌懸液結束要控制在15min以?xún)�，時(shí)間過(guò)長(cháng)會(huì )導致菌體死亡。
2、將滅菌后裝有9mL生理鹽水的試管編號1，2，3，4，5，6，7，8。
3、將一定量的菌加入至編號1的試管中制成第一稀釋梯度菌懸液（通常稱(chēng)為10-1梯度），使用旋渦振蕩器混勻。
4、吸取1mL10-1梯度菌懸液至編號2的試管中，混合均勻，就得到了第二稀釋度的菌懸液（通常稱(chēng)為10-2梯度，若吸取10-1梯度菌懸液100μL至10mL生理鹽水管中，即為百倍稀釋?zhuān)梢灾苯拥玫?0-3梯度菌懸液）。
5、以此類(lèi)推，可以得到10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度菌懸液，每一支管的含菌量都是前一直管的1/10，第8支管的菌液濃度就是第1支管的千萬(wàn)分之一了，如果第一支試管含菌量是109CFU/mL，第8支管就可以得到100CFU/mL左右濃度的菌懸液了。
現在稀釋方法有了，那么如何制備第一支試管的菌懸液及確定第一支試管中菌液的濃度呢？一般采用以下四種方法：
1.麥氏比濁法
將一定量培養好的細菌轉移到第一支試管中（可以用菌液，可以挑取菌落），制備成約5麥氏濁度的均一渾濁的菌懸液（約109CFU/mL），稀釋即可。
優(yōu)點(diǎn)：新手可直接上手操作
缺點(diǎn)：不同細菌體積大小有差別，有些芽孢菌容易聚成團塊不易制得均一懸液；不適用于真菌孢子懸液制備；
注意事項：不同細菌的麥氏濁度與濃度之間存在差異，第一次試驗之前最好先進(jìn)行驗證；麥氏濁度無(wú)法區分細菌死活，因此最好使用新活化的菌制備；真菌（酵母菌）體積較大，同等濁度下濃度約為細菌的1/20。
2、吸光度法
細菌在600nm波長(cháng)處具有最大吸光度，在一定濃度下，細菌的濃度與OD600nm呈正比關(guān)系，因此可以通過(guò)測量OD600nm值來(lái)確定菌懸液濃度。此方法更常用于測定菌液濃度（觀(guān)察細菌生長(cháng)曲線(xiàn)），也可在制備105-107CFU/mL的菌懸液時(shí)使用，不適用于低濃度菌懸液制備。
3、菌液稀釋法
將菌株接種至非選擇性肉湯培養基中過(guò)夜培養，吸取1mL培養物至9mL生理鹽水中制成10-1梯度菌懸液（約108CFU/mL），稀釋至10-6或10-7即可得到10-100CFU/mL菌懸液。
優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單
缺點(diǎn)：菌數不穩定，受細菌種類(lèi)、培養基影響較大；僅適合均勻渾濁生長(cháng)的細菌或真菌；若培養過(guò)程發(fā)生污染，不易察覺(jué)。
注意事項：不同菌株生長(cháng)時(shí)間不同，在不同培養基中生長(cháng)濁度也不同，如大腸埃希氏菌、金黃色葡萄菌、沙門(mén)氏菌等在TSB中過(guò)夜培養即可，乳酸菌通常需在MRS肉湯中培養48-72h，酵母菌、白色念珠菌需在SDB培養基中培養3-5天。酵母菌、芽孢菌通常在10-5稀釋度左右，就可以得到10-100CFU/mL的菌懸液。
4、菌苔稀釋法
從平板或斜面上挑取一定量的菌苔（2-3mm單個(gè)菌落，菌落偏小可多挑幾個(gè)菌落）至9mL生理鹽水中振蕩均勻，制成10-1梯度菌懸液（約108CFU/mL），稀釋至10-7或10-8即可得到10-100CFU/mL菌懸液。
優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，相比較于其他稀釋方法，最大優(yōu)勢就是更容易準確控制菌數濃度；適用范圍廣，細菌、真菌均可采用此方法制備菌懸液。
缺點(diǎn)：需要嘗試和經(jīng)驗
注意事項：不同菌株制成的菌懸液濃度同樣存在差異，初次進(jìn)行特定菌株稀釋時(shí)需要做驗證；一般非芽孢細菌制成的10-1梯度菌懸液約為108-109CFU/mL，而芽孢菌和酵母菌制成的10-1梯度菌懸液約為106-107CFU/mL。
5、總結：
初次進(jìn)行菌液制備時(shí)，可以選用方法1和方法4，多做幾個(gè)稀釋度測試，熟練有經(jīng)驗后使用方法4進(jìn)行菌液制備，可輕松準確制得10-100CFU/mL或20-200CFU/mL濃度菌懸液。
制備好的菌懸液可在驗證過(guò)的時(shí)間內使用，使用時(shí)間一般與稀釋劑有關(guān)，接下來(lái)我們再來(lái)講一下稀釋劑的選擇和應用：
1、0.85%生理鹽水或0.9%氯化鈉溶液：
在國標中通常使用0.85%生理鹽水，中國藥典中常使用0.9%氯化鈉溶液，二者效果無(wú)明顯差別，可適用于絕大多數細菌或真菌的菌懸液或孢子懸液制作（孢子懸液較穩定一般可在2-8℃存放一個(gè)月或者更長(cháng)時(shí)間）。
2、磷酸鹽緩沖液：
與生理鹽水效果接近，可用于菌懸液制備和稀釋?zhuān)Ｓ糜跇悠返南♂尅?/span>
3、0.1%蛋白胨水或pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液：
相比較于生理鹽水，此兩種緩沖液對于產(chǎn)氣莢膜梭菌、生孢梭菌等厭氧菌的效果更好，更能保持細菌的活性。該培養基因含有少量蛋白胨，細菌易發(fā)生繁殖導致菌數發(fā)生變化，通常制備的菌懸液需在短時(shí)間內使用（一般細菌建議在45min內使用，厭氧菌建議在15min內使用）。
上述的方法主要講解了細菌和真菌的菌懸液制備方法，但有時(shí)候我們需要制作一些特殊的懸液，例如霉菌的孢子懸液、芽孢懸液，那么該如何制作呢？
1、霉菌的孢子懸液
將霉菌接種至沙氏瓊脂（或馬鈴薯葡萄糖瓊脂）斜面（或平板）進(jìn)行培養至產(chǎn)豐富的孢子，加入稀釋劑進(jìn)行洗脫（也可用接種環(huán)直接挑取一環(huán)孢子至稀釋液中），再用十倍或百倍稀釋法制成適宜濃度菌懸液。
注意事項：
（1）培養過(guò)程中不可密封培養，保持良好的透氣性有利于霉菌的生長(cháng)和產(chǎn)孢子；
（2）不同的培養基營(yíng)養存在差別，霉菌生長(cháng)后期，培養基內的營(yíng)養逐漸耗盡后，霉菌傾向于開(kāi)始產(chǎn)孢子，因此在培養過(guò)程中不同培養基產(chǎn)孢子時(shí)間存在差異；
（3）孢子容易在空氣中漂浮擴散，因此若采用接種環(huán)挑取孢子時(shí)，應做好防擴散污染的措施。
2、芽孢懸液
將芽孢菌接種至硫酸錳營(yíng)養瓊脂（或其他產(chǎn)芽孢培養基）36±1℃培養5-7天（或其他合適溫度培養），刮取菌苔至稀釋液中制成懸液，將菌懸液置于65℃中水浴30min（或沸水浴10min）殺死菌體，再用十倍稀釋或百倍稀釋法制成適宜濃度的芽孢懸液。
注：制備好的菌懸液原則上應現制現用，但孢子懸液、芽孢懸液相對比較穩定，可以在2-8℃保存較長(cháng)時(shí)間，可在經(jīng)過(guò)驗證的期限內使用。
注：本文屬海博生物原創(chuàng )，未經(jīng)允許不得轉載。
