唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（椰毒假單胞菌酵米面亞種）檢驗方法GB4789.29-2020

1 范圍

本標準規定了食品中唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)[Burkholderia gladioli( Pseudomonas cocovenenans subsp. farino f ermentans>]的檢驗方法。

本標準適用于食品中唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)的檢驗。

2 設備和材料

2.1 實(shí)驗室常規滅菌設備。

2.2 冰箱:2℃～8 ℃、—20℃～—30℃。

2.3 恒溫培養箱:26 ℃士l ℃,36 ℃士l ℃。

2.4 恒溫水浴鍋:46℃士l℃。

2.5 顯微鏡:10倍～100倍。

2.6 均質(zhì)器。

2.7 離心機:3000 r/min。

2.8 電子天平:感量0.l g。

2.9 比濁計。

2.10 錐形瓶:容量100 mI,500 ml.。

2.11 無(wú)菌培養皿:直徑90 mm、直徑150 mm。

2.12 無(wú)菌透明玻璃紙﹑濾紙。

2.13 無(wú)菌灌胃器: l ml。

2.14 微生物生化鑒定系統。

2.15 小鼠:18 g～20 g,每一批次試驗應使用同一品系的KM或ICR小鼠。

3 培養基和試劑

3.1 GVC增菌液。

3.2 改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂(mPDA)。

3.3 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)。

3.4 PCFA培養基。

3.5 馬鈴薯葡萄糖半固體瓊脂。

3.6 卵黃瓊脂。

3.7 革蘭氏染色液。

3.8 氧化酶試劑。

3.9 Hugh-Leifson培養基(O/F試驗用)。

3.10 蛋白胨水(靛基質(zhì)試驗用)。

3.11 緩沖葡萄糖蛋白胨水(MR和V-P試驗用)。

3.12 西蒙氏檸檬酸鹽培養基。

3.13 苯丙氨酸培養基。

3.14 糖發(fā)酵管。

3.15 半固體瓊脂。

3.16 抗O多價(jià)血清、型特異性因子血清(O-Ⅲ,O-Ⅳ,O-Ⅴ,O-Ⅵ,O-Ⅶ,O-Ⅷ)。

3.17 生化鑒定試劑盒。

4 檢驗程序

唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)檢驗程序見(jiàn)圖1。

5 操作步驟

5.1 樣品處理

無(wú)菌操作稱(chēng)取25 g(mL)樣品,置入盛有225 mL GVC增菌液的無(wú)菌均質(zhì)袋中(鮮銀耳樣品取1g，用剪刀剪碎,加入盛有20 mL.GVC增菌液的無(wú)菌均質(zhì)袋中),用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min～2 min;或置入盛有225 mL GVC增菌液的無(wú)菌均質(zhì)杯中,以8000 r/min～10000 r/min均質(zhì)1 min～2 min;若樣品為液態(tài),振蕩混勻。

5.2 增菌

將上述樣品增菌液置36℃士1℃培養20 h～24 h。

5.3 分離

用直徑3 mm的接種環(huán)取增菌液一環(huán),分別劃線(xiàn)接種于mPDA平板和PCFA平板,36 ℃士1℃培養24 h～48 h。觀(guān)察各個(gè)平板上生長(cháng)的菌落,各個(gè)平板上菌落特征見(jiàn)表1。

5.4 初篩試驗

自選擇性瓊脂平板上分別挑取5個(gè)以上典型或可疑菌落(低于5個(gè)全選),分區劃線(xiàn)接種于卵黃瓊脂平板﹐36 ℃士l℃培養。挑取培養18 h～24 h的菌落進(jìn)行革蘭氏染色及氧化酶試驗。對于革蘭氏染色陰性、氧化酶試驗陰性的菌繼續培養至48 h士2 h,對于卵磷脂酶陽(yáng)性,帶有虹彩環(huán)的單個(gè)菌落,接種PDA平板,36 ℃士1 ℃培養24 h士2 h。

5.5 生化試驗

從純培養的PDA平板上挑取菌苔進(jìn)行生化鑒定。唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)生化特征見(jiàn)表2�？蛇x擇生化鑒定試劑盒或微生物生化鑒定系統。

5.6 血清學(xué)分型(可選擇項)

5.6.1 菌體抗原的制備

將PDA平板36 ℃士1℃培養24 h士2 h的培養物用無(wú)菌生理鹽水洗下﹐沸水浴(100 ℃)2 h，3000 r/min 10 min離心棄上清液﹐再用無(wú)菌生理鹽水稀釋至5×108CFU/ml～1×109CFU/ml菌懸液﹐作為凝集試驗用抗原。

5.6.2 菌體抗原的鑒定

用多價(jià)血清做玻片凝集試驗,同時(shí)用生理鹽水做對照。與多價(jià)血清凝集者,依次用O-Ⅲ、O-Ⅳ、O-V、O-Ⅵ、O-Ⅶ、O-Ⅷ因子血清做試管凝集試驗。根據試驗結果,判定菌體抗原型。在生理鹽水中自凝者不能分型。生化特征符合,但不能與以上血清凝集者,需保留菌株做進(jìn)一步鑒定。

5.7 毒性試驗

5.7.1 產(chǎn)毒培養

將初步鑒定為唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)的菌株接種PDA平板,36℃士1℃,培養24 h士2 h,用滅菌接種環(huán)刮取適量菌苔,加到3 mL無(wú)菌生理鹽水的試管中,配成1麥氏濃度(McFarland,MCF)的菌懸液(約為108CFU/mL.),用無(wú)菌吸管吸取0.5 mL,滴在鋪好無(wú)菌玻璃紙的直徑150 mm馬鈴薯葡萄糖半固體平板上,用無(wú)菌L棒涂布均勻,26 ℃士1℃培養5 d。取下帶菌的玻璃紙,將半固體平板置于100 ℃流動(dòng)蒸汽滅菌30 min。室溫冷卻后,置一20 ℃～-30℃冰箱過(guò)夜。將冰凍好的半固體平板置室溫融化,用無(wú)菌吸管吸出凍融液﹐經(jīng)濾紙過(guò)濾至無(wú)菌試管或錐形瓶中(此為毒素粗提液),4℃避光保存。

同時(shí),將未接種菌苔、鋪好無(wú)菌玻璃紙的直徑150 mm馬鈴薯葡萄糖半固體平板作為陰性對照﹐按照同樣的試驗方法制備陰性對照粗提液﹐4℃避光保存。

5.7.2 毒力測定

取毒素粗提液或經(jīng)100 ℃水浴蒸發(fā)后的5倍～10倍濃縮液﹐灌胃小鼠3只，每只0.5 mL,觀(guān)察至7 d。若菌株產(chǎn)生米酵菌酸﹐小鼠在灌胃后20 min～24 h內發(fā)病。主要癥狀為豎毛、萎糜不振、躁動(dòng),繼而行步蹣跚、肢體麻痹、癱軟﹑抽搐,呈角弓反張狀,呼吸急促、死亡。

取陰性對照粗提液或經(jīng)100 ℃水浴蒸發(fā)后的5倍～10倍濃縮液,灌胃小鼠3只,每只0.5 ml.,觀(guān)察至7 d。小鼠應健康存活。

5.7.3 米酵菌酸測定

毒力測定實(shí)驗陽(yáng)性時(shí),分別取毒素粗提液,陰性對照粗提液,按照GB 5009.189執行。

6 結果報告

生化試驗符合且毒性試驗陽(yáng)性,報告檢出唐莒蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)；生化試驗和毒性試驗有一項不符合,報告未檢出唐莒蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)。

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附：GB4789.29唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（椰毒假單胞菌酵米面亞種）檢驗用培養基核算表 點(diǎn)擊下載

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