創(chuàng )傷弧菌檢驗方法GB4789.44-2020

1 范圍

本標準規定了水產(chǎn)品中創(chuàng )傷弧菌( Vibrio vulnificus )的檢驗方法。

本標準適用于魚(yú)、蝦、蟹、貝類(lèi)等水產(chǎn)品中創(chuàng )傷弧菌的檢驗。

2 設備和材料

除微生物實(shí)驗室常規滅菌及培養設備外,其他設備和材料如下:

2.1 恒溫培養箱:36士1℃。

2.2 冰箱:2-5℃.7-10℃。

2.3 恒溫水浴鍋。

2.4 均質(zhì)器或無(wú)菌研缽。

2.5 天平:感量0.1 g。

2.6 PCR儀。

2.7 電泳儀或毛細管電泳儀。

2.8 凝膠電泳成像系統或紫外檢測儀。

2.9 生物安全柜。

2.10 高速離心機(最大轉速至少15000r/min)。

2.11 渦旋振蕩器。

2.12 微量可調移液器(量程2.5μL.10μL、100μL、1000μL)及配套吸頭。

2.13 精密pH試紙或pH計。

2.14 無(wú)菌試管:規格18mmX180mm和15 mmX 100 mm。

2.15 無(wú)菌吸管:規格1 mL(具0.01ml刻度)和10mL(具0.1mL刻度)。

2.16 無(wú)菌錐形瓶:容量250mL、500ml和1000ml。

2.17 無(wú)菌培養皿:直徑90 mm。

2.18 無(wú)菌手術(shù)剪、鑷子、鉗子等。

2.19 PCR反應管。

3 培養基和試劑

3.1 蛋白胨-氯化鈉-纖維二糖-多黏菌素E(PNCC)增菌液。

3.2 纖維二糖-多黏菌素E(CC)瓊脂培養基。

3.3 改良纖維二糖-多黏菌素B-多黏菌素E(mCPC)瓊脂培養基。

3.4 3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂培養基。

3.5 磷酸鹽緩沖液(PBS)。

3.6 3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面。

3.7 嗜鹽性試驗培養基。

3.8 3%氯化鈉賴(lài)氨酸脫羧酶試驗培養。

3.9 3%氯化鈉MR-VP培養基。

3.10 3%氯化鈉溶液。

3.11 氧化酶試劑。

3.12 革蘭氏染色液。

3.13 鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)試劑。

3.14 Voges-Proskauer(V-P)試劑。

3.15 細菌DNA提取試劑盒。

3.16 生化鑒定試劑盒。

3.17 PCR反應配套試劑。

3.18 瓊脂糖凝膠電泳配套試劑。

3.19 具有菌種保藏資質(zhì)單位提供的創(chuàng )傷弧菌標準菌株。

4 檢驗程序

創(chuàng )傷弧菌檢驗程序見(jiàn)圖1。

5 操作步驟

5.1 樣品制備

5.1.1 新鮮樣品采集后應于3h內完成檢驗,若不能在規定時(shí)間內完成,則將樣品置于7℃-10℃條件下保存(因創(chuàng )傷弧菌在4℃條件下極易形成活而不可培養的狀態(tài),因此樣品勿放4℃條件下),并盡可能在24h內完成檢驗;冷凍樣品應在不超過(guò)45℃的溫熱條件下解凍，解凍時(shí)間不超過(guò)15min。

5.1.2 取樣:魚(yú)類(lèi)和頭足類(lèi)取其表面組織、腸和鰓。貝類(lèi)則取全部?jì)热菸?包括貝肉和體液)。甲殼類(lèi)取整個(gè)動(dòng)物或其中心部分(包括腸和鰓)。如為帶殼貝類(lèi)或硬殼甲殼類(lèi),則應先用流動(dòng)自來(lái)水沖洗外殼并用濾紙吸干表面水分,然后無(wú)菌操作打開(kāi)外殼,按上述要求取相應部分。

5.1.3 以無(wú)菌操作取上述處理后的樣品25 g,加人PNCC增菌液225 mL,用旋轉刀片式均質(zhì)器以8000 r/ min均質(zhì)1 min,或用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)2 min,充分混勻制備成1 : 10的樣品勻液。如無(wú)均質(zhì)器,則將樣品放人無(wú)菌乳缽中充分研磨,取磨碎后的樣品25 g轉人500 ml無(wú)菌錐形瓶中,加入PNCC增菌液225 mL,充分振蕩混勻,制備成1 : 10的樣品勻液。

5.2 增菌將5.1.3制備的1 : 10樣品勻液于36士1℃培養18h士1h。

5.3 PCR檢測

PCR實(shí)驗環(huán)境條件和過(guò)程控制應參照GB/T 27403《實(shí)驗室質(zhì)量控制規范食品分子生物學(xué)檢測》規定執行,下同。

5.3.1 DNA模板的制備

在距離PNCC增菌液的液面下1 cm處吸取1 mL置于1.5 mL EP管中,9000r/min離心3 min,棄去上清液。向沉淀中加入1 ml PBS將其懸浮并充分清洗后,9000r/min離心3 min,棄去上清液，按此步驟反復清洗沉淀2次～3次,棄去最后一遍上清液,加入1 ml無(wú)菌超純水,100℃煮沸10 min,繼而12000r/min離心5min,上清液用于PCR分析。若不能及時(shí)分析則于一20C保存備用。也可以用商品化的DNA提取試劑盒按其說(shuō)明書(shū)要求提取制備DNA模板。

5.3.2 PCR擴增

5.3.2.1 引物

信息見(jiàn)表1。

5.3.2.2 對照設置

每次PCR反應使用創(chuàng )傷弧菌標準菌株作為陽(yáng)性對照,同時(shí),使用除創(chuàng )傷弧菌之外的其他弧菌的標準菌株作為陰性對照,以滅菌去離子水作為空白對照。

5.3.2.3 PCR反應體系

見(jiàn)表2。

5.3.2.4 PCR反應程序

預變性:94℃、5min;變性:94℃、1min;退火:62℃、1min;延伸:72℃、1min;循環(huán)數:30;終延伸:72℃、10 min;電泳檢測。若不能立即檢測則4℃保存備用。

5.3.3 電泳

凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。用0.5 X TBE緩沖液配制1.5%的瓊脂糖凝膠(含EB 0.5 rg/mL或Goldview 5 μL/100 ml或Gelred 5 μL/50 ml等DNA染料),取5 μL. PCR擴增產(chǎn)物與1 μl. 6X核酸電泳上樣緩沖液混合后,點(diǎn)樣,同時(shí)有一孔加入DNA分子量標準(范圍為100 bp～1000 bp)。根據以下公式:電泳槽正負極的距離(cm)X5V/em計算并設置電壓,使用0.5XTBE緩沖液恒壓電泳,根據溴酚藍的移動(dòng)位置確定電泳時(shí)間,使用凝膠成像系統或紫外檢測儀觀(guān)察和記錄結果。

5.3.4 結果判定

質(zhì)控系統:陰性對照和空白對照均未出現擴增條帶,陽(yáng)性對照出現預期大小(519 bp)的擴增條帶，則檢測系統正常。否則,任-種對照如果出現非上述正常結果,應重做實(shí)驗,同時(shí)排除污染因素。

陽(yáng)性結果:在質(zhì)控系統正常的情況下,待測樣品出現預期大小(519bp)的擴增條帶,判定PCR結果為陽(yáng)性。

陰性結果:在質(zhì)控系統正常的情況下,待測樣品未出現預期大小(519bp)的擴增條帶,判定PCR結果為陰性。

5.4 分離

用10 μL接種環(huán)在距離PNCC增菌液的液面下1 cm沾取- -環(huán)增菌液,分別劃線(xiàn)接種于CC和mCPC平板,于36℃士1℃條件下培養18 h士1h。典型的創(chuàng )傷弧菌在CC和mCPC平板上的形態(tài)為:圓形、扁平,光照下呈透明或中心不透明但邊緣透明的黃色至橘黃色菌落,菌落直徑1mm～2mm,菌落周?chē)�可出現(或不出現)黃色暈圈。

5.5 分純培養

從CC平板和mCPC平板上各挑取至少5個(gè)創(chuàng )傷弧菌可疑菌落(少于5個(gè)時(shí)全選),分別接種于3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板,36℃士1℃培養18h士1h后用于后續鑒定。創(chuàng )傷弧菌在3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板.上的菌落形態(tài)為圓形、乳白色、濕潤、隆起、直徑1 mm～2mm。

5.6 鑒定

創(chuàng )傷弧菌可采用菌落特征結合生化特性或PCR方法進(jìn)行鑒定。

5.6.1 菌落特征及生化特性

5.6.1.1 初步鑒定

該步驟用于創(chuàng )傷弧菌的初步鑒定,進(jìn)行以下4項鑒定實(shí)驗時(shí),挑取的菌落應來(lái)自分純后的同一個(gè)單菌落。

a)革蘭氏染色鏡檢:從5.5中3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上挑取創(chuàng )傷弧菌疑似菌落進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢。創(chuàng )傷弧菌為革蘭氏陰性,顯微鏡下菌體為棒狀、弧狀、卵圓狀等多種形態(tài),無(wú)芽胞。

b)氧化酶試驗:用接種環(huán)從5.5中3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上挑取創(chuàng )傷弧菌疑似菌落適量,涂布在用氧化酶試劑潤濕(如無(wú)菌濾紙)或滴有氧化酶試劑的白色或無(wú)色載體上(如載玻片)。如果涂菌部位在10 s之內變紫色(偶有藍紫色),即為氧化酶試驗陽(yáng)性,不變色為氧化酶試驗陰性。創(chuàng )傷弧菌為氧化酶試驗陽(yáng)性。

c)三糖鐵試驗:用接種針從5.5中3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上挑取創(chuàng )傷弧菌疑似菌落適量,轉種于3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面并穿刺底層(注意接種針不要觸及試管底部),36℃士1℃培養24h觀(guān)察結果。創(chuàng )傷弧菌在3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面中生長(cháng)時(shí)試管底層變黃,無(wú)氣泡,斜面顏色不變黃(偶有斜面顏色變黃現象)。

d)嗜鹽性試驗:用接種針從5.5中3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上挑取創(chuàng )傷弧菌疑似菌落，分別接種于含0%、3% .6%、8%和10%氯化鈉的胰蛋白胨水中,36℃士1℃培養24h,觀(guān)察液體的混濁情況。創(chuàng )傷弧菌在含0% .8%和10%氯化鈉的胰蛋白胨水中不生長(cháng)或微弱生長(cháng),胰蛋白胨水澄清透亮或稍混濁.而在含3%和6%氯化鈉的胰蛋白胨水中生長(cháng)旺盛,胰蛋白胨水混濁。

5.6.1.2 確證實(shí)驗

將初步鑒定為創(chuàng )傷弧菌的疑似菌落接種在3%氣化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上,36℃士1℃培養18h士1h后,取純培養物分別接種于含3%氯化鈉的賴(lài)氨酸脫羧酶試驗培養基和MR-VP培養基中，36℃士1 ℃培養24 h～48 h后觀(guān)察結果;另取少許純培養物接種于3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面，36℃士1℃培養18h后用于ONPG試驗。也可選擇生化鑒定試劑盒進(jìn)行鑒定。

創(chuàng )傷弧菌生化特性見(jiàn)表3,與其他弧菌的鑒別見(jiàn)表4。

5.6.2 PCR鑒定

本部分試驗可替代5.6.1用于創(chuàng )傷弧菌的快速鑒定。

5.6.2.1 DNA模板的制備

從5.5中3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板.上挑取創(chuàng )傷弧菌疑似菌落,轉至500 μL無(wú)菌超純水中，充分混勻后制成肉眼可見(jiàn)的混濁菌懸液,煮10min,12000r/min離心5min,取上清液用于PCR分析。若不能及時(shí)分析則于一20℃保存備用。也可以用商業(yè)化的DNA提取試劑盒按其說(shuō)明提取制備DNA模板。

5.6.2.2 PCR擴增和電泳

同5.3.2和5.3.3。

5.6.2.3 結果判定

質(zhì)控系統:陰性對照和空白對照均未出現擴增條帶,陽(yáng)性對照出現預期大小(519 bp)的擴增條帶，則檢測系統正常。否則,任一-種對照如果出現非_上述正常結果,應重做實(shí)驗，同時(shí)排除污染因素。

陽(yáng)性結果:在質(zhì)控系統正常的情況下,待測樣品出現預期大小(519bp)的擴增條帶,判定PCR結果為陽(yáng)性，該菌株是創(chuàng )傷弧菌。

陰性結果:在質(zhì)控系統正常的情況下,待測樣品未出現預期大小(519bp)的擴增條帶,判定PCR結果為陰性,該菌株不是創(chuàng )傷弧菌。

5.7 創(chuàng )傷弧菌分型(選做)

5.7.1 DNA模板的制備

取鑒定結果為創(chuàng )傷弧菌的菌株制備DNA模板,制備方法同5.6.2.1。

5.7.2 PCR擴增

5.7.2.1 引物

PCR分型用引物信息見(jiàn)表5。

5.7.2.2 對照設置

每次PCR反應使用含有目的基因的創(chuàng )傷弧菌標準菌株作為陽(yáng)性對照，同時(shí),使用除創(chuàng )傷弧菌之外的其他革蘭氏陰性菌標準菌株作為陰性對照,以滅菌去離子水作為空白對照。

5.7.2.3 PCR反應體系.

同表2。

5.7.2.4 PCR反應程序

預變性:94℃、5min;變性:94℃.1min;退火:55℃(vcg基因)、58℃ (16S rRNA基因)、64℃(Bt2基因及SerE基因)1min;延伸:72℃.1min;循環(huán)數:30個(gè)循環(huán)(vcg基因及16S rRNA基因)、

35個(gè)循環(huán)(Bt2基因及SerE基因);終延伸:72℃、5 min;電泳。若不能及時(shí)電泳檢測,則將擴增產(chǎn)物于4℃短期(1 d～2 d)儲存。

5.7.3 電泳

同5.3.3。

5.7.4 結果判定

質(zhì)控系統:陰性對照和空白對照均未出現擴增條帶,陽(yáng)性對照出現預期大小的擴增條帶,則檢測系統正常。否則,任--種對照如果出現非上述正常結果,應重做實(shí)驗,同時(shí)排除污染因素。在質(zhì)控系統正常的情況下,如果待測菌株出現97 bp大小的條帶,則判定該株創(chuàng )傷弧菌為vcg℃型;如果出現199 bp大小的條帶,則判定該株創(chuàng )傷弧菌為vcg E型;

如果待測菌株出現285bp大小的條帶,則判定該株創(chuàng )傷弧菌為16SrRNAA型,如果出現839bp大小的條帶,則判定該株創(chuàng )傷弧菌為16SrRNAB型,如果同時(shí)出現285bp大小和839bp大小的兩條帶,則判定該株創(chuàng )傷弧菌為16SrRNAA/B型;

如果待測菌株出現665 bp大小的條帶,則判定該株創(chuàng )傷弧菌為血清E型;如果待測菌株出現344 bp大小的條帶.則判定該株創(chuàng )傷弧菌為生物1I型。

6 結果與報告

根據菌落特征、生化特性或PCR鑒定結果,報告25g樣品中檢出或未檢出創(chuàng )傷弧菌。

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附：GB4789.44 創(chuàng )傷弧菌檢測用培養基核算表  點(diǎn)擊下載

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